论文部分内容阅读
研究背景：恶性胶质瘤高达5/10万的患病率，使其在世界范围内仍是一个难题，其中美国每年新发现的患病人数高达14000例，我国每年可达55000左右，且近年统计数据表明恶性胶质瘤发病率呈增长态势。其中胶质母细胞瘤的比例占到恶性胶质瘤的60-70%。虽然各种先进的设备、技术的应用给肿瘤治疗带了福音，但是恶性胶质瘤死亡率仍无下降走势，有效降低恶性胶质瘤的死亡率仍然是世界性的研究热点，因次探究有效地治疗措施以提高恶性胶质瘤的临床控制率势在必行。近几年研究显示，真核生物mRNA转录、翻译成蛋白质的过程中翻译起始因子eIFs是起关键作用的一类蛋白分子，其中eIF4E作为治疗恶性肿瘤的靶向目标日益受到重视。mRNA转录、翻译成蛋白质是一个基本的过程，但是有合理的控制系统，主要控制发生在起始阶段。在真核细胞中，eIF4F复合物由eIF4E、eIF4A以及eIF4G共同组成，启动具有5’帽子结构的mRNA的翻译过程。 eIF4E结合蛋白（eIF4Ebinding proteins,4E-BPs）控制着eIF4F复合物能否成功装配。4E-BPs的磷酸化水平是其与eIF4E结合的关键，PTEN/PI3K/AKt/mTOR信号转导通路在4E-BPs的磷酸化过程中起主导作用，同时需要mTOR对氨基末端RAIP基序和羧基末端TOS基序的识别。RAIP基序具有识别4E-BP2氨基末端以及羧基末端磷酸化位点的功能，而S65以、T70以及雷帕霉素的磷酸化敏感位点由TOS基序识别。综上所述，我们考虑同时剔除RAIP和TOS基序能够抑制4E-BP2被磷酸化，进而阻止eIF4F复合物的组合，从而抑制肿瘤细胞的生长并且促进凋亡。中医药是祖国医学的“瑰宝”，也是肿瘤防治研究的一个重要领域。近年来研究显示中草药藏红花（Crocus sativus L, Saffron）的有效成分藏红花素（Crocin）对多种肿瘤细胞具有明显的抗癌活性，且几乎未发现正常组织细胞生理功能受到影响，有望成为一种新型的天然抗癌药物[56,57]。目前有关藏红花素对胶质瘤的抗瘤作用及机制研究，国际上尚未见相关报道，国内仅有个别报道[50]。实验目的：删除4E-BP1cDNA、4E-BP2cDNA中的RAIP和TOS基序编码序列，构建真核表达载体，其中4E-BP1作为备用。在此基础上，从分子生物学水平探索截短型4E-BP2对大鼠胶质瘤细胞C6的细胞增殖、凋亡的影响以及相关蛋白的表达情况；探索藏红花素对大鼠C6胶质瘤细胞生长及对凋亡蛋白抑制因子Livin和Survivin表达的影响。实验方法及结果⑴用反转录聚合酶链反应和分子克隆技术构建截短型4E-BP1、4E-BP2的真核表达载体，并且利用双酶切以及测序的方法鉴定其正确性。结果显示插入序列与设计序列一直。⑵通过MTT法和碘化丙啶（PI）标记流式细胞术检测细胞增值能力。结果表明：短型4E-BP2能够抑制大鼠胶质瘤细胞C6的增殖。⑶倒置显微镜和Hoehst荧光染色观察细胞形态的变化和凋亡情况；结果表明：藏红花素对胶质瘤C6细胞的增殖具有抑制作用。⑷通过流式细胞术以及透射电镜检测细胞凋亡水平。结果表明：截短型4E-BP2能够促进大鼠胶质瘤细胞C6的凋亡。⑸通过Western blot方法检测相关蛋白表达水平。结果表明:截短型4E-BP2能够抑制C6中肿瘤相关蛋白的表达；藏红花素能够下调Survivin和Livin蛋白的表达。