【摘 要】
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目的:研究和确认RUNX3对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。方法:BMP9腺病毒感染间充质干细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测内源性Runx3的基因水平,通过Western Bl
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目的:研究和确认RUNX3对BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的影响。方法:BMP9腺病毒感染间充质干细胞,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测内源性Runx3的基因水平,通过Western Blot检测内源性RUNX3蛋白的表达。构建过表达RUNX3(Ad-RUNX3)和干扰RUNX3(Ad-siRUNX3)的腺病毒,通过RT-PCR进行验证。利用过表达RUNX3(Ad-RUNX3)和干扰RUNX3腺病毒(Ad-siRUNX3)处理间充质干细胞,通过碱性磷酸(ALP)染色和活性定量测定,检测成骨早期指标ALP;用茜素红S染色,检测成骨晚期指标钙盐沉积。同时用流式细胞仪检测RUNX3对BMP9诱导的间充质干细胞增殖和周期的影响。利用RT-qPCR检测成骨相关转录因子Id1、Id2、Dlx5和Runx2的基因表达;利用Western Blot检测DLX5和RUNX2的蛋白表达;通过Western Blot检测RUNX3对经典的BMPs/Smad信号通路中Smad1/5/8和非经典的MAPK信号通路中p38和ERK1/2的变化。结果:BMP9可以使MSCs中RUNX3基因和蛋白表达升高(p<0.05);过表达和干扰RUNX3都可以增强BMP9诱导的早期成骨指标ALP活性,增加S期细胞的比例以及上调成骨相关转录因子Id1和Id2的基因表达(p<0.05);过表达RUNX3可以增强BMP9诱导的晚期成骨指标钙盐沉积,而干扰RUNX3可以抑制BMP9诱导的晚期成骨指标钙盐沉积。过表达RUNX3促进BMP9诱导的成骨相关转录因子DLX5和RUNX2的基因和蛋白表达,干扰RUNX3抑制DLX5和RUNX2的基因和蛋白表达(p<0.05)。过表达RUNX3促进BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化,干扰RUNX3抑制BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化,对总的Smad1/5/8蛋白水平无影响。RUNX3不影响BMP9诱导的p38、ERK1/2的磷酸化水平。结论:RUNX3在调控BMP9诱导间充质干细胞向成骨分化过程中发挥重要作用,而且主要是通过影响经典的BMPs/Smad信号通路来实现的。
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