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猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2, PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原,也可引起猪皮炎肾病综合征(PNDS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)及肠炎和繁殖障碍等。多年来PCV2在我国规模化猪场中已广泛存在,成为我国养猪业的三大疫病之一,也是全球公认的危害养猪业的重要疫病,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。PCV2含有2个功能性的开放阅读框(ORF),即ORF1编码的与病毒滚环复制相关的Rep蛋白,ORF2编码的核衣壳(Cap)蛋白。ORF2编码的核衣壳(Cap)蛋白是病毒唯一的结构蛋白,包含主要的抗原中和表位,具有良好的免疫原性,是作为基因工程亚单位疫苗和血清学诊断研究的首选基因。本实验利用基因重组技术将PCV2ORF2基因克隆至原核和真核表达系统中,制备获得了具有生物学活性的重组Cap蛋白,并进行了免疫原性研究。具体实验和结果如下：1.为了提高PCV2Cap蛋白在大肠杆菌中的表达,本实验通过人工合成的方法将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,以改造后合成的PCV2ORF2基因为模板,参照合成序列设计一对引物,并在其上下游引物5’端分别引入BamH I, HindⅢ酶切位点,PCR扩增出全长ORF2基因,PCR回收产物与经同样酶切处理的PET-32a表达载体连接,转化DH5α感受态细胞挑取阳性克隆,经PCR和测序鉴定后提取质粒,再转化Rosetta表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中得到表达,且通过密码子优化目的蛋白大部分以可溶性形式存在于上清中,纯化后测得蛋白浓度为998ug/mL. Western Blot分析表明获得的重组蛋白能被PCV2多克隆阳性血清所识别,具有良好的反应原性。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰白兔,制备出针对Cap蛋白的兔多克隆抗体。2.为了探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型Cap蛋白作为亚单位疫苗的应用价值。本实验将PCV2Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBac I中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA (Bacmid-Cap),用Cellfectin传染试剂将提取的Bacmid-Cap转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明：在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白；Western Blot结果显示：重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有免疫学反应性；应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示：该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。成功分泌表达了PCV2Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生体液免疫应答。