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目的：优化悬浮培养的白血病细胞电穿孔转染的条件。将携带WT1基因四种异构体全长cDNA的真核表达载体转导白血病细胞株NB4，建立稳定表达的单克隆细胞株。探讨WT1基因及其异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4增殖、分化、凋亡等生物学行为的影响及其分子机制。 方法：通过调整电压、电容、细胞状态、温度及缓冲液等不同转染条件，以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，用流式细胞仪和荧光显微镜观察转染效率，优化悬浮培养白血病细胞的电穿孔转染条件。用电穿孔的方法分别将对照质粒pCB6+及携带WT1基因四种主要异构体WTA（-17aa/-KTS）、WTB（+17aa/-KTS）、WTC（-17aa/+KTS）、WTD（+17aa/+KTS）全长cDNA的真核表达载体转导白血病细胞株NB4，建立稳定表达外源基因的细胞株并用有限稀释法进行单克隆化。采用台盼蓝拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成试验及细胞周期动力学检测，了解表达外源性WT1基因异构体WTA从而将WT1基因异构体表达的比例由+17AA/+KTS优势型转变为-17AA／-KTS优势型对NB4细胞生长的影响。通过形态学观察，NBT还原试验，细胞表面分化抗原CD11b的检测了解外源性表达WT1基因异构体WTA对NB4细胞分化的影响。用DNA凝胶电泳，流式细胞仪测定AnnexinV结合力等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的作用。用RT-PCR方法检测WT1基因异构体WTA转导NB4细胞后，NB4细胞PML／RARα、RbAP46、p21、P53、Bcl-2、Bcl-XL、VEGF和C-myc等相关基因表达的改变。运用cDNA微阵列技术检测WT1基因异构体表达比例的转变对NB4细胞基因表达谱的影响。并用RT-PCR方法验证CyclinA1及CDK7基因表达的改变。 结果：①低电压、高电容能高效转染悬浮培养的人白血病细胞，细胞类型不同条件有所差异，NB4细胞在350V、950μF得到最大转染率32.9％（转染48小时后）。②WT1基因异构体能够通过电穿孔方法成功转染白血病细胞株NB4，外源基因在NB4细胞中稳定整合及表达，并能通过有限稀释法将永久表达细胞株单克隆化。③用台盼蓝拒染法绘制细胞生长曲线，提示转染WT1基因异构体的细胞NB4／WTA生长明显慢于对照组NB4／CMV细胞及未转染的NB4细胞，NB4／WTA细胞生长曲线平缓，在第3天达平台期（78.7±18）×104／ml，对照组NB4／CMV细胞及NB4细胞在第四天出现生长平台期达（146±21）×104／ml。MTT法检测细胞增殖活性，结果显示，NB4／WTA细胞在各个时间段的A值均低于对照组，统计学处理有显著性差异，盯1基因异构体对白血病细胞生物学行为影响的研究中文提要P<0005。甲墓纤维素集落形成试验中NB扩wTA克隆形成率明显下降，集落形成抑制率为46.9%。在三氧化二砷AsZO:（终浓度0.2 pM）作用后集落形成抑制更加明显。细胞周期动力学检测提示，NB礴/WTA组S期细胞比例升高。④细胞受全反式维甲酸ATRA（终浓度0.5 pM）诱导细胞分化48小时，细胞形态检测提示，NB月/WTA细胞出现部分分化，而对照组细胞分化更为明显。流式细胞仪检测NB4/WTA细胞CD llb相对荧光强度（4 .63士1 .63）低于对照组（8.巧士1 .84），被ArRA（终浓度0.5林M）作用24小时后CDllb相对荧光强度（31.42士5.65）与对照组（71.95士9.36）相比降低更为明显，有显著统计学意义（P<0.01）。NB扩Wl人细胞NBT还原能力较对照组下降，当采用AIRA.（终浓度。.5林M）处理细胞1一3天后，两组细胞之间的NBT还原能力的差异更加明显。⑤MTT实验显示，NB月/WTA细胞对AsZO:的IC50值较对照组明显降低，分别为0.814士0.132和1.439士0.215，有显著性差异（P<0.02）。经AsZO3（终浓度0.8“M）作用48小时，NB月八Vl，A细胞AnnexinV结合力较对照组细胞升高，出现更为典型的凋亡形态学改变，DNA凝胶电泳可见更明显的DNA梯形带。⑥Rl、pCR检查提示， NB4阿TA细胞pN且了RARa、RbAP46、p21、C一myc基因的表达较对照组升高，Bcl一2表达下降，p53、VEGF、Cyeli山l、eyeli心2、Bcl一XL基因表达无明显改变。⑦通过表达谱芯片筛选，发现转导WTI基因异构体WTA后，NB4细胞中共89条与细胞周期相关基因、细胞凋亡相关基因、癌基因以及细胞信号和传递蛋白等基因表达出现变化。RT一PCR验证了与细胞周期相关的CycllnAI基因表达上调，CDK7基因表达下调。 结论:①wTI基因异构体能够通过电穿孔的方法成功转染悬浮培养的白血病细胞NB4，并建立单克隆化的永久表达细胞株。②增加外源性WTI基因异构体WTA的表达从而将WTI基因异构体表达的比例由+1 7AA/十KTS优势型转变为一17AA/一KTS优势型能抑制白血病细胞株NB;的增殖，使其克隆形成能力明显下降。同时也能部分抑制ATRA对NB;细胞的诱导分化作用，使NB;细胞对AsZO3引起的凋亡更为敏感。这些改变可能与PML爪AR。、PZI、C一myc等基因的表达上调，Bcl一2基因的表达下调有关。③WTI基因异构体WTA表达比例增加能引起NB;细胞基因表达谱的改变，这些基因的改变可能对白血病细胞增殖、分化和凋亡等生物学行为产生了一定的影响。