口腔癌是对于口腔中恶性肿瘤的统称,是头颈部较常见的恶性肿瘤之一,也是世界上恶性程度排名第八的肿瘤。据报道,中国人口腔癌的发病率是3.29例/10万。由于位置的特殊性,一般口腔鳞状细胞癌在早期不易被人察觉,确诊后五年生存率比较低,主要原因在于没有做到早期发现、早期预防,确诊时癌细胞已经向颈部淋巴结转移,此类患者即便手术也很难完全切除,且口腔癌对放化疗并不敏感,因此这类患者的预后往往不容乐观。为了提高口腔癌患者的治愈率和生存率,我们需要对头颈部鳞状细胞癌的侵袭、淋巴结转移和抗凋亡机制进行研究。影响肿瘤预后好坏的一个重要因素是肿瘤是否发生转移。肿瘤转移是指肿瘤从原发部位通过血液、淋巴道等途径迁移到其他部位的过程。趋化因子是指一种使白细胞移行到炎症部位的一些低分子量的蛋白质,其能够与相应受体结合,使肿瘤细胞沿着趋化因子浓度增加的信号向信号源处迁徙,从而调控肿瘤细胞的迁移和侵袭。CXCR4是一种趋化因子。作为CXCL12的受体,CXCR4是目前肿瘤研究最为广泛、最具有特征性的趋化因子受体。尽管不同的研究显示,CXCR4与肿瘤的转移有关,但是关于口腔鳞状细胞癌的研究比较少。因此,CXCR4可能成为肿瘤治疗的新一靶点,对于CXCR4阳性的肿瘤组织进行靶向干预治疗可能成为肿瘤的新方法。通过抗体封闭技术和RNA干扰技术阻断CXCR4都能够抑制肿瘤细胞的侵袭。通过使用趋化因子受体拮抗剂、抑制剂等来下调趋化因子的表达,从而阻断趋化因子配体及受体的信号传导通路,可因此对肿瘤细胞迁移和侵袭、增殖、凋亡等生物学作用产生抑制作用。因此,为了探讨CXCL12-CXCR4生物轴在口腔鳞状细胞癌转移中的作用,我们用荧光定量PCR、免疫组织化学方法、蛋白质免疫印迹方法对不同分期及有无淋巴结转移的口腔鳞状细胞癌患者组织中的CXCR4表达进行检测,并分析CXCR4表达与口腔鳞状细胞癌临床病理特征间的关系。目前,趋化因子和相应受体在越来越多的科学研究中被发现,其有能促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移的能力。现在,研究较多的是基质衍生因子(stromal derived factor-1,SDF-1,即CXCL12)及其受体CXCR4构成的CXCL12/CXCR4生物学轴,已经证实CXCL12/CXCR4生物学轴在乳腺癌、恶性黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌等恶性肿瘤定向转移、浸润和转移过程中发挥了主要作用。口腔鳞状癌的浸润和转移也是涉及多个基因和多种因素的参与和相互作用的结果。因此,探究人口腔鳞状癌增殖及转移的分子机制,探索有效治疗的靶点,将要成为积极治疗口腔鳞状癌患者有效的重要突破。趋化因子CXCL12即基质细胞源性因子衍生因子,深入参与到各种肿瘤细胞的增殖、侵袭等生命过程。CXCR4是CXCL12的受体。CXCR4是高度保守的7次跨膜G蛋白耦联受体,CXCL12-CXCR4生物轴具有重要的生物学功能,涉及到细胞凋亡,周期,迁移等。本研究将探讨CXCL12/CXCR4生物学轴在口腔鳞癌中的表达,以及对于口腔鳞癌中的发生、发展、浸润、转移中进一步了解CXCL12/CXCR4生物学轴与最强的CXCR4阻断剂之间的关系,为口腔鳞癌的治疗、预后等提供新的研究方向。本研究对CXCR4拮抗剂TN14003对CXCL12/CXCR4生物学轴调控口腔鳞癌细胞生长及浸润、转移的分子机制进行了如下实验研究。研究共分为三个部分:第一部分:我们针对2010-2016年于天津市肿瘤医院头颈科手术切除及活检的75例具有完整临床病例资料的样本,分析影响口腔鳞癌术后生存率的相关因素。通过完整的病理资料的口腔鳞癌标本特点,以正常口腔粘膜组织及良性肿瘤组织为对照。将口腔鳞状细胞癌肿瘤组织样本根据临床病理资料分期(I,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ),根据分化程度分为高分化和低分化两组,根据有无淋巴结转移情况分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组两组。将肿瘤组织提取总RNA和总蛋白,荧光定量PCR检测CXCL12和CXCR4的基因表达,western blot方法检测CXCL12和CXCR4和蛋白表达水平。另外对肿瘤组织和癌旁组织进行固定、包埋、切片,免疫组化方法检测CXCL12和CXCR4的表达。第二部分:从细胞水平,将人口腔鳞状癌细胞分为对照组、TN14003高中低浓度组,每个组分设不同时间组。在特异性拮抗剂TN14003阻断CXCR4后,MTT实验和克隆形成实验检测细胞的增殖情况,流式细胞术AnnexinV/PI染色和TUNEL实验检测细胞凋亡情况,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况,Western blot实验检测CXCL12-CXCR4和相关信号通路蛋白的表达情况。第三部分:扩增细胞,裸鼠腋下种植构建人口腔鳞状细胞癌的移植瘤模型,将动物分为空白组,对照组和TN14003给药组。给药4周后处死动物,检测肿瘤组织大小。Western blot和免疫组化方法检测肿瘤组织的CXCR4的表达,以验证这种作用是否是通过调控CXCL12-CXCR4的表达来实现的。结果:对于不同分期的肿瘤样本组织进行CXCR4基因表达检测,与I期相比,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期CXCR4表达显著升高(P<0.05);与Ⅱ期相比,Ⅲ,Ⅳ期CXCR4表达显著升高(P<0.05);与Ⅲ期相比,Ⅳ期CXCR4表达显著升高(P<0.05)。发生转移和未发生转移的肿瘤组织进行CXCR4基因表达检测,与良性对照组相比,肿瘤组织的CXCR4基因表达显著升高(P<0.05);与发生转移的肿瘤组织相比,未发生转移的肿瘤组织CXCR4表达显著降低(P<0.05)。对于淋巴结转移与未转移的淋巴组织进行CXCR4基因表达检测,与未转移组的淋巴组织相比,转移组的淋巴组织的CXCR4基因表达显著升高(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,在TN14003作用24h后高浓度组相对于对照组凋亡率发生了显著增加(p<0.05),48h和72h后低浓度和高浓度组的细胞增殖相较于48h和72h对照组分别都发生了显著增加(p<0.05)。克隆形成结果显示,在TN14003作用24h后,高浓度组相对于对照组发生了显著抑制,48h和72h后低浓度和高浓度组的细胞增殖相较于48h和72h对照组分别发生了显著抑制(p<0.05)。q-PCR和western blot检测结果显示,在TN14003作用24h后,高浓度组相对于对照组CXCR4的基因和蛋白表达显著降低,48h和72h后低浓度和高浓度组处理的细胞CXCR4基因和蛋白表达与48h和72h对照组分别都发生了显著降低(p<0.05)。对于CXCL12的表达,各组之间不存在显著性差异。TN14003处理4周后的裸鼠,口腔鳞癌细胞生长受到显著抑制。q-PCR western blot检测结果显示,TN14003处理组的裸鼠肿瘤组织中,CXCR4表达相对于对照组和空白组显著降低(p<0.05)。对于CXCL12的表达,各组之间不存在显著性差异。结论:1.在口腔鳞癌中,CXCR4与肿瘤分期直接相关,随着肿瘤分期的提高,CXCR4表达随之升高。CXCR4与肿瘤转移直接相关,转移的肿瘤组织中CXCR4表达显著升高。在发生肿瘤转移的患者淋巴组织中,CXCR4表达显著升高。2.TN14003处理能够显著抑制口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞的凋亡。3.TN14003处理能够在体内显著抑制口腔鳞癌细胞的生长和侵袭。4.TN14003对口腔鳞癌细胞在体内、体外的作用是通过抑制CXCR4的表达不是CXCL12表达,同时通过调节AKT/mTOR和GSK3β/βcatenin改变细胞的凋亡和侵袭性而实现。