本研究分为以下三部分： 第一部分：HCMV耐药监测的实验室方法学建立 目的：建立常规实验室监测HCMV耐药的表型分析和基因型分析方法。 方法：采集临床接受更昔洛韦(GCV)治疗HCMV感染3个月以上的肾、肝、骨髓或造血肝细胞移植患者和HCMV先天性感染的婴幼儿肝炎患者外周血和尿液，接种至人胚肺成纤维细胞MRC-5上，同时接种HCMV标准株AD169为对照，体外分离培养HCMV，待出现细胞病CPE变达100％后，收集病毒培养物，然后测定病毒感染性滴度TCID50，再采用噬斑减少法分析临床HCMV分离株的耐药表型，即以100×TCID50病毒量接种至MRC-5细胞，将GCV作系列浓度稀释并加入培养基中，以相同量接种HCMv标准株AD169作为对照。每个药物浓度做4个复孔以求均值计算分析。GCV敏感性表型分析结果以同不加药物孔比较能抑制50％细胞出现病变的药物浓度即IC50表示。基因型分析采用巢式PCR方法直接扩增HCMV感染患者的外周血白细胞中的HCMV-UL97片段，对扩增产物进行测序，同HCMV标准株AD169序列比对，参照国外报道的耐药相关的热点突变，初步判定各临床分离株的耐药基因型。 结果：共获得33株HCMV临床分离野毒株，其中6株来自肾移植患者，27株来自HCMV先天性感染的婴幼儿肝炎患者。GCV药物敏感性测定结果显示其中32株为GCV药物敏感型，其IC50在1.5～5.0μM之间，有一株来自肾移植患者的GCVIC50为12.5μM，高于HCMV标准株AD169(1.5μM)8倍，被判定为表型耐药。再次重复以上测定结果相同，耐药基因型检测分析显示该HCMV临床株的UL97基因发生M460V突变。其余32株同IHCMV标准株AD169的序列基本一致，未发现含已知耐药突变，为野生型。同时发现33株HCMV临床分离株中UL97基因多态性-D605E型占63.6％(21/33)。 结论：HCMV耐药表型检测和基因型检测的实验室方法初步建立，通过对33株HCMV临床分离株的耐药分析证实两种方法结果完全符合，而基因型分析因能直接扩增HCMV感染者的外周血标本，无需进行病毒分离，所需时间短，结果可靠而显示其优越性，可以在临床实验室中广泛开展，使快速准确地对HCMV疑似耐药患者进行耐药监测成为可能。 第二部分：更昔洛韦预防和治疗HCMV感染后耐药基因型分析 目的：通过对HCMV耐药相关基因序列分析检测耐药病毒株，进一步了解更昔洛韦治疗HCMV感染后基因型耐药突变发生的频率、类型以及突变热点的分布状况。 方法：对上海市瑞金医院2002-2007年内359例各类移植患者外周血进行HCMV耐药基因型检测，其中肾移植250例、肝脏移植69例、骨髓移植或造血干细胞移植40例，和收治的先天性HCMV感染的儿科患者36例。同时收集患者抗HCMV药物及免疫抑制药物的使用情况和临床感染症状等资料。基因型耐药分析标本来自移植患者术前和术后，先天性感染患者治疗前后的动态连续监测HCMV感染的血样共2500份，首先以HCMV-PP65抗原检测和HCMV-DNA定量检测证实其是否为HCMV感染性样本，再经白细胞分离，抽提核酸，用巢式PCR扩增HCMV耐药相关基因UL97序列并将所获产物进行序列测定，同国外已报道的耐药突变位点比较分析。对国外未见报道的UL97基因的多态性或突变型则结合患者临床资料和实验室病毒学检测结果加以综合分析。 结果：经检测证实359例患者中105例被确诊为HCMV活动性感染，从HCMV感染患者的样本中扩增出UL97基因并进行了序列测定。各研究群体的UL97基因耐药性突变的发生率为：肾移植：2/70(2.9％)，耐药基因型为：L595W，C607F。肝移植：0/18(0.0％)，骨髓和造血干细胞移植：1/17(5.9％)，耐药基因型为：M460V。GCV平均暴露60天。先天性HCMV感染中无1例检出UL97基因耐药突变，同时发现UL97基因多态性D605E型占该群体的70％，而在移植群体中D605E型所占比例明显偏低，与国外报道不径相同。另外发现有2例肾移植和1例造血干细胞移植患者在术后抗病毒治疗监测过程中出现了新的UL97突变基因型：C518Y，同时伴随临床HCMV持续感染症状，HCMV-DNA拷贝数持续上升，提示抗病毒治疗无效。更换抗病毒药物后HCMV感染得以控制，此时该患者UL97基因的C518Y突变恢复为野生型。 结论：我国HCMV耐药现状不容乐观，更昔洛韦耐药发生率尚略低于国外报道。但UL97基因突变具有自身特点，即发现国外尚未报道的新突变型，那么这些新的突变位点是否引起耐药尚有待进一步的验证。从生物学角度出发，需要结合大量临床耐药分离株的特性对病毒耐药基因进行结构和功能的全面分析研究，从临床角度，需要大量资料总结分析治疗后耐药出现的时间和患者的临床表现情况，从而为选择正确的治疗方案提供有效依据。 第三部分：HCMV主要耐药基因UL97变异及其与耐药相关性研究 目的：构建含UL97基因目的突变C518Y的重组HCMV(rHCMV)，将目的突变引入HCMV标准株AD169，通过对重组病毒的耐药表型和基因型分析来确定该突变型是否和耐药相关。 方法：采用两次重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)对UL97基因进行定点突变，引入PmeI位点，在此位点存在的基础上再次采用该法引入耐药相关位点的定点突变(C518Y)，并且克隆、纯化获得一定量目的片段。同时，将HCMVAD169株接种至MRC-5细胞，当细胞病变近100％时收获病毒培养液，通过超速低温离心获得纯病毒颗粒，采用以阴离子交换树脂为介质抽提纯化病毒基因组DNA。将纯化的HCMV基因组DNA与含C518Y突变的UL97目的片段按10:1比例混合(以不含目的片段仅有AD169基因组DNA做为对照)，分别用磷酸钙和脂质体介导两种方法共转染人胚肺成纤维细胞MRC-5。在宿主细胞内目的片段和HCMV基因组DNA发生同源重组，以观察细胞病变效应(CPE)的形成来判断重组病毒形成与否。当细胞病变达100％后，收集病毒培养物，将收获的病毒培养物接种MRC-5细胞，换用含50μMGCV的细胞培养液培养，筛选带有目的突变基因位点的重组病毒，再将单个噬斑进行纯化增殖培养，获得目的重组病毒，通过对耐药基因UL97进行扩增后酶切鉴定和测序来分析重组病毒的基因型。同时对UL54基因也进行扩增和测序分析用以排除重组病毒中含因UL54的基因突变而导致耐药性的改变。对基因型符合预期的重组病毒再通过噬斑减少实验测定其耐药表型。 结果：经两步SOE-PCR扩增反应成功构建含耐药点突变(C518Y)目的基因片段，将HCMV基因组DNA与耐药突变目的片段按一定比例共转染MRC-5，7～14天明显可见CPE，脂质体转染效率优于经典的磷酸钙转染。经间接免疫荧光检测HCMV-PP65蛋白证实为病灶为重组HCMV所形成。当将抗HCMV药物GCV的浓度提高到50μM，仍能见到病毒感染性病灶的出现，而对照标准实验株AD169被完全抑制。继续将耐药毒株进行克隆后作UL97400～707密码子区域基因扩增测序分析，显示重组病毒在UL97基因518密码子发生Cys-to-Tyr(TGT-to-TAT)突变，在584～586密码子为PmeI特异识别位点序列，与预期结果完全一致。而测得UL54基因序列也同野生株完全一致，与AD169株比较除目的突变外未见其它任何氨基酸的改变。重组病毒的耐药表型测定显示对GCV的耐受性(IC50为15μM)是标准株AD169的12倍。 结论：成功地在体外将HCMV基因组DNA与耐药点突变目的基因片段通过脂质体介导共转染MRC-5细胞，获得含目的突变的重组耐药病毒HCMV(C518Y)。经耐药表型测定显示了重组病毒具有GCV耐药性，以此判定该点突变和耐药产生相关。本研究中建立的分子转移实验技术可用于评估在抗病毒治疗过程中出现的新突变型的耐药性。此方法的建立为在用药过程中不断出现的新的HCMV耐药突变株的鉴定分析提供了有效的技术平台，丰富了UL97基因的多态性和现有耐药谱的调查，为建立快速监测HCMV耐药毒株的实验室检测方法提供了坚实的基础。