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前言:趋化因子是一类由不同类型细胞分泌的对免疫细胞具有趋化作用的细胞因子。CCL21是趋化因子成员之一,主要在淋巴结和脾脏高表达,此外大多数器官的淋巴管内皮也有表达。CCR7是CCL21的受体,在幼稚T细胞、B细胞及树突细胞表面表达。生理条件下,CCL21/CCR7在调节淋巴细胞归巢及免疫反应过程中发挥着重要作用。研究发现,多种肿瘤细胞高表达CCR7,如乳腺癌、胃癌、头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌等,CCR7的表达与这些肿瘤的淋巴结转移密切相关。Noelia等报道了,在成熟树突细胞中趋化因子CCL19、CCL21能促进PI3k/Akt和ERK的活化,促进细胞增殖,抑制凋亡。然而,CC21/CCR7对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响却不清楚。本研究的目的是研究CCL21/CCR7对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。
材料与方法:
1、细胞培养:A549和H460细胞使用含10％胎牛血清(Hyclone,美国)的DMEM-F12及RPMI1640培养液(Sigma,美国),于37℃、5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。
2、siRNA干扰:A549和H460细胞分别接种到6孔板中,根据Lipofectamine2000产品说明书,细胞贴壁后用无血清培养2-3h后进行转染,6-8h后换为含10％血清的培养基继续培养,根据实验需要培养24h。
3、CCK-8分析:处于对数生长期的A549和H460细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔接种1×103个细胞,培养0h、24h、48h或72h后检测。在测定前每孔加入10μLCCK-8溶液后孵育4h。在450nm处用酶标仪测定吸光值。
4、流式细胞仪:应用流式细胞仪检测A549和H460细胞周期分布和细胞凋亡情况。
5、RT-PCR和real-time PCR:取对数生长期的细胞用TRIZOL(Invitrogen,美国)提取总RNA,逆转录,PCR扩增,1.5％琼脂糖凝胶电泳,用Image J软件进行表达强度分析。Real-time PCR,根据SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)试剂盒的说明书操作。所有反应均设置三个复孔,以β-actin为内参照。
6、Western blot:收集细胞,提取总蛋白,50微克总蛋白经10％和12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,电转移至PVDF膜。结果经Image J软件进行灰度定量分析。
7、免疫共沉淀(CoIP):按照CoIP试剂盒说明书操作,检测蛋白与蛋白的相互作用情况。
8、统计分析:使用SPSS16.0统计学软件进行数据处理;用单因素方差分析评价各种处理组间的不同,随后的亚组分析用LSD检验或Dunnett T3检验;趋势分析采用多项式对比;数据以三次独立实验的均数±标准差表示,P＜0.05为差异有统计学意义。
结果:
1、CCL21/CCR7通过ERK途径促进G2/M期进展,增强非小细胞肺癌A549和H460细胞增殖。
(1)CCL21/CCR7促进了A549和H460细胞的增殖:CCK-8分析显示,当A549和H460细胞暴露到外源性CCL21后,与对照组相比,其增殖能力明显增强,随着暴露时间的增加表现为一种线性趋势,而CCR7被CCR7 siRNA后,CCL21的这些影响消失。
(2)CCL21/CCR7改变了A549和H460细胞G2/M期的分布:流式细胞仪分析显示,外源性CCL21作用于A549和H460细胞24h后,其G2/M期的分布发生明显改变,而G0/G1期和S期没有明显变化;CCR7被CCR7siRNA后,CCL21的这些影响消失。
(3)CCL21/CCR7上调了A549和H460细胞cyclin A、cyclin B1和CDK1的表达:real-time PCR和western-blot分析证实,CCL21/CCR7显著上调TcyclinA、cyclin B1和CDK1的表达(与G2/M期进展有关),而没有明显影响cyclin D1和cyclin E(分别与G1期和S期进展有关)的表达。
(4)CCL21/CCR7通过ERK途径调控A549和H460细胞增殖:在A549和H460细胞中,检测了CCL21/CCR7对PI3k/Akt和MAPK途径的影响,结果发现CCL21/CCR7可激活ERK途径,而对Akt、p38和JNK没有明显的影响。细胞暴露到PD98059(一种MEK的特异性抑制剂,其抑制后可破坏下游ERK的激活)后,再用外源性CCL21刺激细胞,发现CCL21/CCR7的促增殖等效应消失。免疫共沉淀进一步证实CCL21/CCR7是通过ERK途径促进G2/M期蛋白表达,调控A549和H460细胞增殖。
2、CCL21/CCR7通过ERK途径调节Bcl-2/Bax和Caspase-3表达,抑制非小细胞肺癌A549和H460细胞凋亡。
(1)CCL21/CCR7抑制A549和H460细胞凋亡:外源性CCL21作用于A549和H460细胞24h后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果发现CCL21/CCR7显著抑制了细胞凋亡。
(2)CCL21/CCR7通过上调抗凋亡因子Bcl-2及下调促凋亡因子Bax和Caspase-3基因的表达抑制细胞凋亡,与p53途径没有明显关系:应用real-time PCR和westem blot检测细胞凋亡相关基因Bcl-2/Bax,Caspase-3和p53的表达情况,发现CCL21/CCR7可明显上调Bcl-2的表达及下调Bax和Caspase-3的表达,对p53表达没有明显影响。
(3)CCL21/CCR7通过激活ERK途径抑制A549和H460细胞凋亡:细胞暴露到PD98059(一种MEK的特异性抑制剂,其抑制后可破坏下游ERK的激活)后,再用外源性CCL21刺激细胞,结果发现CCL21/CCR7的抗凋亡效应消失。免疫共沉淀进一步证实CCL21/CCR7是通过ERK途径上调Bcl-2及下调Bax和Caspase-3基因的表达,抑制A549和H460细胞凋亡。
结论:
1、CCL21/CCR7通过激活ERK途径促进G2/M期进展,增强非小细胞肺癌细胞增殖能力。
2、CCL21/CCR7通过激活ERK途径上调抗凋亡因子Bcl-2及下调促凋亡因子Bax和Caspase-3基因的表达,抑制非小细胞肺癌细胞凋亡。