研究背景近年来随着纳米技术的高速发展,碳纳米管（carbon nanotube,CNT）由于其特定的大小、形状、化学特性、表面活性和良好的导电性能被广泛应用于汽车制造、航空航天、生物医药等领域。碳纳米管可分为单壁碳纳米管（single-walled CNT,SWCNT）和多壁碳纳米管（multi-walled CNT,MWCNT）,大量CNTs的生产和应用增加了职业工人及消费者的暴露机会和健康危害风险,包括肺部功能的降低、肺部炎症和肺纤维化的发生。因此,预防CNTs对暴露人体潜在的危害已经成为亟待解决的公共卫生问题之一。目的1、通过动物实验阐明肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AMs）极化在CNTs暴露诱导小鼠肺纤维化中的作用。2、利用体外研究揭示CNTs暴露促进M2型AMs极化诱导上皮细胞-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和肺成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（fibroblast-myofibroblast transition,FMT）介导肺纤维化的机制。3、利用动物实验结合体外si RNA干预等手段,探讨SWCNT暴露诱导M2型AMs极化的分子机制。研究方法1、CNTs特征分析:高分辨透射电子显微镜观察CNTs形态;zeta电位分析CNTs溶液的稳定性;沉淀实验观察CNTs的沉淀效率;内毒素试剂盒检测CNTs溶液内毒素水平。2、体外实验2.1观察CNTs暴露不同时间对小鼠原代AMs极化影响:提取8-10周龄正常C57BL/6J小鼠AMs,设置对照组、M1极化组、M2极化组、SWCNT组、MWCNT（s）组和MWCNT（l）组。对照组给予PBS处理,M1/M2极化组分别给予LPS（48 h）+IFN-γ（24 h）或IL-4处理48 h,SWCNT组、MWCNT（s）组和MWCNT（l）组在M1或M2极化条件下分别暴露50μg/ml SWCNT、短型MWCNT和长型MWCNT6 h、12 h和24 h后收集细胞并评价AMs极化改变。2.2观察AMs极化在三种不同种类CNTs促进肺支气管上皮细胞EMT和肺成纤维细胞FMT中的作用:收集2.1中不同组别的培养基上清作为条件培养基培养BEAS-2B细胞和小鼠原代肺成纤维细胞48 h后收集细胞,检测BEAS-2B细胞钙黏蛋白E（E-cadherin,E-cad）和波形蛋白（Vimentin）蛋白表达以及肺成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和胶原蛋白（CollagenⅠ）蛋白表达,分别评价其EMT和FMT水平。2.3探究CNTs促进M2型AMs极化介导肺支气管上皮细胞EMT和肺成纤维细胞FMT的机制:基于条件培养基实验的基础上,分别给予BEAS-2B细胞和肺成纤维细胞TGF-β、IL-10或TGF-β抑制剂处理后收集细胞,检测BEAS-2B细胞E-cad和Vimentin蛋白表达以及肺成纤维细胞α-SMA蛋白表达,分别评价其EMT和FMT水平。2.4体外探究C/EBPβ是否调控M2型AMs极化介导的肺支气管上皮细胞EMT和肺成纤维细胞FMT:提取8-10周龄正常小鼠AMs,设置对照组、NC（normal control）组、M2极化组、SWCNT组、SWCNT+NC组和SWCNT+C/EBPβsi RNA组。对照组、M2极化组和SWCNT组处理方式如2.1所述,NC组给予NC si RNA处理,SWCNT+NC组和SWCNT+C/EBPβsi RNA组在SWCNT暴露基础上分别给予NC si RNA和C/EBPβsi RNA预处理。收集上述不同组别的培养基上清作为条件培养基培养BEAS-2B细胞和小鼠原代肺成纤维细胞48 h后收集细胞,检测BEAS-2B细胞E-cad和Vimentin蛋白表达以及肺成纤维细胞α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达,分别评价其EMT和FMT水平。3、动物实验3.1观察三种不同种类CNTs暴露不同时间对AMs极化和肺纤维化的影响:8-10周龄C57BL/6J小鼠分为对照组、SWCNT、MWCNT（s）和MWCNT（l）组（每组12只）,对照组、SWCNT、MWCNT（s）和MWCNT（l）组通过气管滴注方式分别给予PBS、40μg/只SWCNT、短型MWCNT和长型MWCNT,继续喂养3天、7天和28天后剖杀小鼠,取小鼠肺泡灌洗液和肺组织,从小鼠肺泡灌洗液中提取AMs,评价肺纤维化水平和AMs极化水平。3.2进一步验证M2型AMs极化在SWCNT介导肺纤维化中的作用（由于3.1部分发现SWCNT相较于MWCNT有着更强的致纤维化能力,因此后续选择SWCNT进一步探索其机制）:48只8-10周龄C57BL/6J小鼠分为对照组、SWCNT组、SWCNT+Ig G组和SWCNT+anti IL-4组（每组12只）。对照组和SWCNT组通过气管滴注分别给予PBS和40μg/只SWCNT。SWCNT+Ig G组和SWCNT+anti IL-4组在SWCNT暴露基础上通过腹腔注射方式分别给予1 mg Ig G和IL-4中和抗体（每周一次）处理,SWCNT暴露28天后剖杀小鼠,取小鼠肺泡灌洗液和肺组织,从小鼠肺泡灌洗液中提取AMs,评价肺纤维化水平和AMs极化水平。3.3探究SWCNT调控M2型AMs极化的可能机制:24只8-10周龄C57BL/6J小鼠分为对照组、SWCNT组（每组12只）。对照组和SWCNT组通过气管滴注分别给予PBS和40μg/只SWCNT。SWCNT暴露28天后剖杀小鼠,从小鼠肺泡灌洗液中提取AMs,检测15种可能调控M2型巨噬细胞极化的基因（AMPKα、BMP4、B7-H3、C/EBPβ、Fox O1、Herpub1、IRF4、KLF4、PPARγ、PIP1B、RBP-J、STAT3、STAT6、TIPE2和TRAF6）m RNA表达,免疫荧光检测AMs C/EBPβ表达。4、实验方法（1）HE染色观察肺组织形态;（2）Masson染色和羟脯氨酸试剂盒检测肺组织纤维化水平;（3）免疫组织化学法和Western Blotting检测小鼠肺部组织和BEAS-2B EMT水平以及小鼠肺组织和小鼠原代成纤维细胞FMT水平;（4）流式细胞术检测F4/80+CD11c+和F4/80+CD206+AMs（5）免疫荧光检测AMs F4/80、CD11c、CD206和C/EBPβ表达水平（6）RT-PCR检测AMs i NOS、Arg-1、TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10和15种可能调控M2型巨噬细胞极化的基因（AMPKα、BMP4、B7-H3、C/EBPβ、Fox O1、Herpub1、IRF4、KLF4、PPARγ、PIP1B、RBP-J、STAT3、STAT6、TIPE2和TRAF6）m RNA表达水平;（7）ELISA检测肺泡灌洗液和培养基上清i NOS和Arg-1活性以及TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10和IL-4含量。结果1、TGF-β参与调控CNTs促进M2型AMs极化介导EMT和FMT1.1、小鼠原代AMs在LPS+IFN-γ（M1极化条件）和IL-4（M2极化条件）分别向M1型和M2型AMs极化M1极化条件下,小鼠原代AMs CD11c阳性表达显著上升,AMs i NOS m RNA表达和培养基上清中i NOS活性显著增加,同时LPS+IFN-γ上调AMs TNF-α和IL-6m RNA表达和含量。在M2极化条件下,小鼠原代AMs CD206阳性表达显著上升,AMs Arg-1 m RNA表达和培养基上清中Arg-1活性显著增加,同时IL-4上调AMs TGF-β和IL-10 m RNA表达和含量。1.2、CNTs暴露6 h（M1极化条件）促进AMs向M1型极化,CNTs暴露24 h（M2极化条件）促进AMs向M2型极化在M1极化条件下,CNTs暴露6 h显著上调F4/80+CD11c+AMs以及AMs i NOS、TNF-α和IL-6 m RNA水平,同时,CNTs暴露6 h后,AMs培养基上清中i NOS活性以及TNF-α和IL-6含量显著增加。在M2极化条件下,CNTs暴露24 h显著上调F4/80+CD206+AMs以及AMs Arg-1、TGF-β和IL-10 m RNA水平,同时,CNTs暴露24 h后,AMs培养基上清中Arg-1活性以及TGF-β和IL-10含量显著增加。1.3、TGF-β参与调控CNTs促进M2型AMs极化介导EMT和FMT条件培养基实验表明,CNTs暴露6 h的AMs对BEAS-2B细胞EMT和肺成纤维细胞FMT无明显影响。然而,CNTs暴露24 h的AMs促进BEAS-2B细胞EMT和肺成纤维细胞FMT。进一步地,TGF-β处理加重CNTs诱导BEAS-2B细胞EMT和原代肺成纤维细胞FMT。TGF-β抑制剂处理缓解CNTs诱导BEAS-2B细胞EMT和原代肺成纤维细胞FMT。2、CNTs暴露诱导小鼠肺纤维化与AMs极化的关系2.1、CNTs暴露早期引起小鼠肺部炎症,暴露后期引起小鼠肺纤维化CNTs暴露上调小鼠肺系数和肺组织羟脯氨酸水平并且呈现时间-效应关系。HE结果表明,CNTs暴露3天引起小鼠肺部炎性细胞的增加,CNTs暴露7天和28天引起小鼠肺泡壁增厚。Masson染色结果显示,CNTs暴露7天引起小鼠肺部组织胶原沉积,暴露28天胶原沉积进一步加重。免疫组织化学法和Western Blotting结果显示,CNTs暴露7天和28天后,小鼠肺组织E-cad蛋白表达降低,同时,Vimentin、α-SMA和CollagenⅠ表达显著增加。2.2、CNTs暴露早期促进M1型AMs极化,暴露后期促进M2型AMs极化CNTs暴露3天显著上调小鼠F4/80+CD11c+AMs以及AMs i NOS、TNF-α和IL-6m RNA水平,同时,CNTs暴露3天后,小鼠肺泡灌洗液中i NOS活性以及TNF-α和IL-6含量显著增加。CNTs暴露7天和28天后上调小鼠F4/80+CD206+AMs以及AMs Arg-1、TGF-β和IL-10 m RNA水平,同时,CNTs暴露7天和28天后,小鼠肺泡灌洗液中Arg-1活性以及TGF-β和IL-10含量显著增加。2.3、M2型AMs极化参与调控SWCNT诱导的肺纤维化IL-4中和抗体抑制小鼠肺泡灌洗液IL-4表达。进一步地,IL-4中和抗体降低SWCNT上调的M2型AMs极化及其相关细胞因子（TGF-β和IL-10）的分泌,IL-4中和抗体增加了SWCNT下调的小鼠肺部组织E-cad表达,同时,IL-4中和抗体减少了SWCNT上调的小鼠肺部组织Vimentin、CollagenⅠ和α-SMA的蛋白表达。3、C/EBPβ参与调控SWCNT促进的M2型AMs极化3.1、SWCNT上调小鼠AMs C/EBPβ表达动物实验结果显示,SWCNT暴露28天上调小鼠AMs C/EBPβ、KLF4、IRF4和STAT6 m RNA表达,其中,SWCNT上调C/EBPβm RNA表达最为突出。免疫荧光结果表明,SWCNT上调AMs C/EBPβ蛋白表达。因此,C/EBPβ可能参与调控SWCNT诱导的M2型AMs极化。3.2、沉默C/EBPβ降低SWCNT上调的M2型AMs极化体外结果显示,在M2极化条件下,SWCNT暴露24 h促进AMs C/EBPβ蛋白表达,C/EBPβsi RNA处理后,SWCNT上调的F4/80+CD206+AMs以及AMs Arg-1、TGF-β和IL-10 m RNA水平显著降低,同时,C/EBPβsi RNA降低SWCNT上调的AMs培养基上清中Arg-1活性以及TGF-β和IL-10含量。因此,沉默C/EBPβ可以降低SWCNT上调的M2型AMs极化及其相关细胞因子的分泌。3.3、C/EBPβsi RNA缓解SWCNT诱导的EMT和FMT条件培养基实验结果显示,SWCNT处理24 h的AMs促进肺支气管上皮细胞EMT的发生。与SWCNT组比较,SWCNT+C/EBPβsi RNA组BEAS-2B细胞E-cad蛋白表达显著增加并且Vimentin蛋白表达显著降低,提示C/EBPβsi RNA缓解了SWCNT诱导肺支气管上皮细胞EMT。进一步地,SWCNT处理24 h的AMs促进原代肺成纤维细胞FMT的发生,与SWCNT组比较,SWCNT+C/EBPβsi RNA组肺成纤维细胞α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达显著降低,提示C/EBPβsi RNA缓解SWCNT诱导原代肺成纤维细胞FMT。结论CNTs暴露早期促进M1型AMs极化和肺部炎症,暴露后期促进M2型AMs极化和肺纤维化,其中,SWCNT诱导M2型AMs极化和肺纤维化能力最为突出。通过IL-4中和抗体处理小鼠揭示了M2型AMs极化参与调控SWCNT诱导的肺纤维化,体内和体外实验进一步阐明了SWCNT通过上调C/EBPβ促进M2型AMs极化介导肺纤维化。