前言：　　胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)是由于各种原因使胰岛素在周围组织摄取和清除葡萄糖的效率下降，机体代偿性的分泌过多的胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。肥胖可以导致IR的发生，而IR又是肥胖症、高血压病、血脂代谢异常等的代谢综合征的共同危险因素。因此，胰岛素抵抗一直是内分泌的研究热点。胰岛素抵抗和肥胖已经成为一个世界性的问题，导致内分泌和代谢的改变。胰岛素是机体控制血糖稳定的首要调节因子，可促进葡萄糖在骨骼肌和脂肪组织中的代谢，通过抑制糖原分解和糖异生来抑制肝脏的葡萄糖输出。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，对机体功能物质的代谢及能量稳态的维持起主要作用。肝脏胰岛素抵抗主要是指胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能量下降。目前对其发生的分子生物学机制的研究颇受关注。　　增食欲素A(Orexin A)和增食欲素B(Orexin B)是下丘脑释放的神经肽类激素，它们通过与两个G蛋白偶联受体OX1R和OX2R结合来发挥生物学效应。OX1R和OX2R在中枢神经系统和外周组织如肾上腺、消化道、胰腺、睾丸及脂肪组织等部位分布广泛。增食欲素及其受体参与许多生理过程如食物摄入、睡眠与觉醒、生殖行为、能量平衡及血糖调节等。最近的研究表明，orexin系统还参与细胞增殖与凋亡的调控。　　尽管对于增食欲素及其受体的研究较为广泛，但是在肝细胞中的研究较少。本研究通过高脂饮食喂养建立胰岛素抵抗肥胖大鼠模型，应用高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验证实模型的建立，观察orexin A及其受体OX1R，受体后信号转导通路PI3K/Akt及其下游元件Foxo1和mTORC1在胰岛素抵抗肥胖大鼠体内的表达改变，orexinA及其受体OX1R对大鼠肝细胞的增殖与凋亡的调节，探讨orexinA及其受体OX1R对大鼠肝细胞功能的调节作用及其可能的分子机制。　　实验方法：　　一、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠肝脏组织中的表达研究　　选择8周龄SPF级雄性SD大鼠40只，随机分为2组:正常对照组(NC组)、高脂饮食组（HF组）。NC组予以普通颗粒饲料、HF组予以高脂饲料，饲养8周。8周后，各组大鼠称取体重，每组随机选取5只进行高胰岛素-正常葡萄糖钳夹实验验证胰岛素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心脏取血，分别进行血糖、血脂、胰岛素、orexin A水平测定。处死大鼠后，留取肝脏组织，应用免疫组化检测肝脏组织OX1R定位表达。　　二、Orexin A及OX1R干预肝细胞增殖和凋亡的研究　　体外培养大鼠肝脏细胞，分别加入不同浓度的orexin A和/或OX1R特异性抑制剂(SB334867)，RT-PCR测肝细胞内OX1RmRNA表达，western-blot技术检测细胞蛋白表达;MTT法检测细胞增殖;凋亡试剂盒检测细胞凋亡。　　三、Orexin A及OX1R调节肝细胞内PI3K/Akt、Foxo1、mTORC1信号通路的研究　　体外培养大鼠肝细胞，分别加入0，10-10，10-8和10-6M orexin A或SB334867或PI3K/Akt特异性拮抗剂(LY294002)或Foxo1抑制剂AS1842856或mTORC1抑制剂everolimus进行干预进行干预，western-blot检测Akt、Foxo1及mTORC1蛋白活性。　　实验结果：　　一、Orexin A及OX1R在高脂饮食诱导的胰岛素抵抗肥胖大鼠中的呈规律性表达　　1、胰岛素抵抗肥胖大鼠体重及内脏脂肪变化:　　喂养至8周时，HF组大鼠体重较NC组明显升高，内脏脂肪与体重百分比显著高于NC组。　　2、胰岛素抵抗肥胖大鼠血清生化指标的变化:　　HF组大鼠血清TG、TC、LDL-C均显著高于NC组，HDL-C均显著低于NC组，FBG水平有所升高，但是无显著性差异。　　3、胰岛素抵抗肥胖大鼠血清胰岛素的变化:　　HF组大鼠FINS较NC组明显升高，但GIR明显降低。　　4、胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A及OX1R的变化:　　ELISA结果显示:胰岛素抵抗肥胖大鼠体内orexin A水平较NC组降低。免疫组化结果显示:大鼠肝脏组织有OX1R免疫阳性细胞表达，并且HF组肝脏组织OX1R阳性染色颗粒较NC组降低。　　二、Orexin A及OX1R干预肝细胞增殖和凋亡功能　　1、Orexin A对肝细胞OX1R蛋白活性和mRNA表达的影响:　　不同浓度（10-10，10-8，10-6）的orexin A均可刺激肝细胞OX1R mRNA表达增加，其中10-6M和10-8组效应具统计学意义。　　2、Orexin A对肝细胞增殖的影响:　　不同浓度(10-10，10-8，10-6M)的orexin A均可诱导肝细胞增殖，其中10-8M和10-6M orexinA组效应有统计学意义，OX1R特异性抑制剂、Akt抑制剂、mTORC1抑制剂均可抑制这种作用。而Foxo1抑制剂不能抑制orexin A的促增殖作用。　　3、Orexin A对肝细胞凋亡的影响:　　不同浓度（10-10，10-8，10-6M）的orexin A可减少肝细胞凋亡，其中10-8M和10-6M浓度的orexin A差异具有统计学意义。加入OX1R特异性拮抗剂、Akt抑制剂和mTORC1抑制剂可抑制这种凋亡保护作用。加入Foxo1抑制剂后，orexin A减少肝细胞凋亡的作用不被抑制。　　三、Orexin A及其受体1 OX1R调节肝细胞内PI3K/Akt、Foxo1和mTORC1信号通路的研究　　1、培养液中加入不同浓度的Orexin A（0，10-10，10-8，10-6M），其中10-8M和10-6M orexin A可使Akt磷酸化蛋白表达水平上调，总蛋白表达水平无明显改变。加入Akt抑制剂或OX1R拮抗剂时，Akt蛋白活性可被抑制。　　2、培养液中加入不同浓度的Orexin A。10-8M和10-6M orexin A可使Foxo1磷酸化蛋白表达水平上调，总蛋白表达水平无明显改变。加入Akt抑制剂或OX1R拮抗剂时，Foxo1蛋白活性可被抑制。　　3、培养液中加入不同浓度的Orexin A。10-6M orexin A可使mTORC1磷酸化蛋白表达水平上调，总蛋白表达水平无明显改变。加入Akt抑制剂或OX1R拮抗剂时，mTORC1蛋白活性可被抑制。　　结论：　　1、胰岛素抵抗肥胖大鼠体内血浆orexin A水平下降，其受体OX1R在肝脏组织的肝细胞胞浆内表达减少，说明其可能参与肝细胞功能的调节。　　2、外源性orexin A可以通过OX1R途径促进体外的肝细胞增殖，并抑制肝细胞凋亡。　　3、orexin A通过OX1R正性调节大鼠肝细胞内Akt、Foxo1、mTORC1信号转导通路，参与肝细胞增殖和凋亡的调节。