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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种世界范围广泛寄生于人和多种脊椎动物有核细胞中的机会性致病原虫。弓形虫能够感染人、猪、牛、马、羊和鹿等动物,导致孕妇或母畜流产、死胎、畸胎和弱智儿,对人类的生命健康和畜牧业的发展造成严重的威胁。鉴于弓形虫的高度感染率及其在人体医学和畜牧医学中的重要性,探究弓形虫的致病机理和研制安全有效的疫苗显得极其重要,这也是预防和控制人类和动物弓形虫病的重要措施。为此,本研究用RH株弓形虫速殖子感染293T细胞,验证RH株弓形虫速殖子对293T细胞NF-kB信号通路的激活与抑制；通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)验证4个体内诱导抗原假定蛋白基因体内外表达的差异；并将其与已经验证过的3个体内外诱导抗原功能基因构建真核表达质粒,探索这些重组质粒对293T细胞中NF-kB信号通路的激活与抑制；以弓形虫体内诱导抗原基因JK483877、 JK483898构建DNA疫苗,并在BALB/c小鼠中检测该疫苗的免疫保护性。(1)弓形虫速殖子全虫对293T细胞的NF-kB信号通路影响收集纯化过的RH株弓形虫速殖子并接种293T细胞,根据双荧光数值分析,RH株弓形虫速殖子能够显著的激活293T细胞中的NF-kB信号通路；收集纯化过的RH株弓形虫速殖子接种293T细胞,用TNF-α刺激细胞,根据双荧光数值分析,RH株弓形虫速殖子不能够抑制由TNF-α诱导的NF-kB的活化,随着RH株速殖子接种比例增加,激活该通路的倍数持续增加。(2)通过real-time PCR验证体内诱导抗原基因的体内外差异表达针对体内诱导抗原基因JK483877、 JK483880、 JK483881、 JK483898序列,设计引物,通过real-time PCR验证了在体内条件下速殖子感染BALB/c小鼠72h和体外条件下BHK细胞培养弓形虫速殖子72h后,4个体内诱导抗原基因在宿主体内表达量均高于体外表达量,经统计学分析差异显著(P<0.05)。(3)构建体内诱导抗原基因真核表达质粒将上述4个体内诱导抗原基因和功能基因C-18、 MIC11、 PI一起构建真核表达质粒,设计针对该7个基因的全长引物,通过PCR扩增出目的片段,连接到克隆载体pMD19-T中鉴定正确后再连接到真核表达载体PCMV-Tag2B上,成功构建真核表达质粒。(4)验证构建的重组表达质粒对293T细胞的NF-kB信号通路影响将重组质粒转染293T细胞,根据双荧光数值分析,所构建的7个体内诱导抗原真核表达质粒均不能激活293T细胞的NF-kB信号通路,也不能够抑制293T细胞的NF-kB信号通路,虽然有几个体内诱导抗原基因有抑制的趋势,但是趋势不是很明显,不具有统计学意义。(5)体内诱导抗原JK483877、 JK483898免疫原性研究通过间接免疫荧光(IFA)证明重组表达质粒能够被弓形虫兔多克隆抗血清特异性识别,具有较好的抗原性。利用TLA-ELISA未在实验组的免疫鼠血清中检测到特异性的TLA抗体,与对照组无明显差异；通过细胞因子ELISA实验,未见实验组小鼠产生高水平的IL-2、 IL-4、 IL-12及IFN-γ;淋巴细胞增殖实验中,实验组鼠淋巴细胞相对于空载体组和PBS组并未见显著的增殖；小鼠腹腔接种RH株弓形虫速殖子,空载体组小鼠于在8天内全部死亡,两组疫苗组小鼠在攻虫15天后均有1只小鼠存活,但是PBS组仍有2只小鼠存活。以上结果表明,构建的DNA疫苗没有诱导机体产生特异性弓形虫抗体,不具有保护力。本研究通过验证构建的重组质粒对NF-kB信号通路的激活与抑制,鉴定JK483877、 JK483898的免疫原性,从而对NF-kB信号通路的活化机制以及弓形虫疫苗的研究奠定了理论基础。