论文部分内容阅读
目的:成釉细胞瘤(ameloblastoma,AB)是口腔颌面部最常见的牙源性肿瘤,约占60%以上。AB虽属良性肿瘤,但具有交界性肿瘤的性质。AB多发于青壮年,以下颌体及下颌角部常见。初期患者多无自觉症状,随着病情进展,颌骨逐渐膨大,造成畸形,肿瘤最终可穿透骨质,周围软组织遭受侵犯。AB最重要的生物学特性是具有局部侵袭性。目前,针对AB仅限于外科手术治疗,但术后容易导致复发,复发多次还可能发生恶变甚至远处转移,患者的生存质量受到严重的影响。因此,准确揭示AB的发病机制,将会为AB的预防以及探寻新的治疗途径提供理论指导。微小RNA(microRNA,miRNA)是广泛存在于真核生物中的一组长度大概为22个核苷酸的非编码单链RNA家族,其通常在转录后水平调控基因的翻译表达。有报道表明miRNA广泛存在于各种真核细胞中,参与机体的生长发育、细胞凋亡、脂肪代谢等过程。同时,miRNA在肿瘤的发生发展中也发挥着至关重要的作用。miR-300是一类新发现的miRNA,目前对其研究较少,之前的文献对于miR-300的报道更多集中在血液病中。本实验将对miR-300的研究转移到肿瘤的发病机制中,探讨其在AB中的功能并进一步探索作用机制,具有十分重要的意义。本实验应用基因芯片及生物信息学技术,筛选在AB差异性表达的miRNA(miR-300);通过细胞功能学实验研究其在AM-1细胞中发挥的作用;根据生物信息学预测,对其潜在的靶点进行验证,并通过靶点分子的敲除,探讨对靶点的调控意义;同时对miR-300发挥调控作用的通路进行初步探讨。本实验结果将为进一步探讨miR-300在AB发病中的作用及其分子调控机制提供科学依据。研究方法:1、应用Human miRNA表达谱芯片技术,筛选在AB中差异性表达的miRNA,通过生物信息学技术及应用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)验证,最终确定miR-300为后续研究对象。2、采用qRT-PCR方法,检测15对AB及瘤旁组织中miR-300的表达情况,同时采用Western blot、qRT-PCR和免疫组化的方法检测Periostin在AB及瘤旁组织中的表达情况。3、选用成釉细胞瘤细胞系(AM-1)作为研究对象,采用转染技术,将miR-300化学合成模拟物转染至细胞中,应用MTS、流式细胞术、Transwell等实验方法,观察其对AM-1细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭等生物学行为的影响。4、利用在线生物信息学预测网站对miR-300的作用靶点进行初步预测及筛选,采用Western blot、qRT-PCR的方法等证实靶基因mRNA和蛋白水平表达的变化,通过构建荧光素酶实验的靶向序列进行鉴定,并进一步使用RNA干扰等实验来明确靶向调控关系和其对Rankl/OPG信号通路的影响。结果:1、miRNA芯片结果发现,与对照组(NOM)相比,AB组miRNA表达量变化在2.0倍以上,且有统计学差异(P<0.05)的miRNA确定为差异表达的miRNA。miR-300在AB中的表达是对照组的0.29倍(P<0.05),差异有统计学意义,最终确定miR-300为下一步研究的对象。2、qRT-PCR结果显示miR-300在15例AB中的相对表达量显著低于瘤旁组织(P<0.05);qRT-PCR和Western blot结果显示Periostin在15例AB中的相对表达量显著高于瘤旁组织(P<0.05);应用Pearson相关分析发现miR-300与Periostin在AB中的表达呈负相关;应用免疫组织化学染色检测Periostin在AB中的相对表达量显著高于NOM(P<0.05),且与疾病的复发密切相关。3、通过对AM-1细胞转染miR-300 mimics来过表达细胞中的miR-300,MTS和Transwell侵袭实验显示与对照组相比,AM-1细胞的增殖和侵袭能力明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测显示转染miR-300 mimics到AM-1细胞中,引起细胞G1/G0期阻滞,但细胞凋亡率没有显著变化。4、根据生物信息学分析,我们预测Periostin可能是miR-300的主要靶基因。miR-300负向调控Periostin的表达;双荧光素酶活性检测实验证实miR-300可以与Periostin 3’UTR区特定的位点结合,过表达miR-300后,可抑制Periostin 3’UTR WT组相对荧光素酶活性。5、通过对AM-1细胞转染si-Periostin来降低细胞中的Periostin,MTS和Transwell侵袭实验显示与对照组相比,AM-1细胞的增殖和侵袭能力明显降低(P<0.05);流式细胞仪检测显示转染si-Periostin到AM-1细胞中,引起细胞G1/G0期阻滞,但细胞凋亡率没有显著变化,这和miR-300 mimics在AB中的功能相一致。6、通过对AM-1细胞转染miR-300 mimics,miR-300 inhibitor和si-Periostin,qRT-PCR和Western blot结果显示与对照组相比,转入miR-300inhibitor+si-Periostin-2组Rankl、OPG、C-fos的表达无明显变化(P>0.05);转入miR-300 mimics组和转入si-Periostin组的结果相同,Rankl、C-fos的表达都明显降低,而OPG的表达都明显升高(P<0.05);相反,转入miR-300 inhibitor组Rankl、C-fos表达明显升高,而OPG mRNA的表达明显降低(P<0.05),OPG蛋白的表达却无明显变化(P>0.05)。结论:1、结合Human miRNA表达谱芯片技术,我们发现了miR-300在AB中低表达,Periostin在AB中高表达,miR-300与Periostin的表达负相关,且Perisotin的表达与AB复发密切相关。2、过表达miR-300可以显著抑制AM-1细胞增殖和侵袭能力,使AM-1细胞发生细胞周期阻滞,但对AM-1细胞的凋亡无明显影响。3、Periostin是miR-300作用的靶基因。4、MiR-300通过靶向Periostin调控Rankl/OPG信号通路。