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背景及目的:环孢素A（CsA）是一种在临床上广泛运用于肾脏、心脏、肝脏等器官移植的强大免疫抑制剂,能够很大程度降低器官移植后排斥反应的发生,除此之外,环孢素A也常与肾上腺皮质激素联合使用治疗免疫相关疾病。但随着环孢素A的广泛运用,临床使用时有许多副作用,如临床常见的肾毒性、肝毒性等,但它是否具有导致心脏毒性尚不明确,且机制不清。因此,我们利用斑马鱼作为模式动物评估CsA对胚胎心脏发育的毒性。方法:Tg（my17:GFP）转基因鱼系斑马鱼的胚胎于1%亚基蓝中培养12小时,转移至六孔板中,每孔20颗。将12hpf的斑马鱼胚胎暴露于于5mg/L、10mg/L、15mg/L三种浓度至72hpf,连续3天换液换药,于72hpf观察记录药物处理的斑马鱼的发育状况及心脏的发育状况,使用Zesis Discovery 20系统测量并记录各组斑马鱼20秒心率,斑马鱼的心包面积、体长、卵黄囊面积、静脉窦到动脉球的距离（SV-BA）。每组测量15条,实验重复3次。收集药物处理至72h的斑马鱼幼虫进行苏木精-伊红染色,观察心脏组织学变化。使用Tg（kdrl:m Cherry）转基因鱼系胚胎进行CsA暴露,于激光共聚焦显微镜下观察心肌与心内膜的变化情况。分别在0hpf、12hpf、15.5hpf、19hpf、48hpf进行首次CsA暴露,观察并记录各时间段各组斑马鱼的心脏发育情况,测量并记录各时间段各组斑马鱼心包面积及SV-BA的距离。使用野生型AB斑马鱼系的胚胎进行CsA暴露,于药物处理72h收集斑马鱼幼虫进行活性氧（ROS）染色和吖啶橙（AO）染色,同时提取各实验组总蛋白测定超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的酶活性水平,通过实时荧光定量PCR测定心脏发育相关基因gata4、vmhc、klf2a、nkx2.5、P53、mdm2、Bax、β-catenin、lef1、axin-2的表达水平。使用虾青素和wnt信号通路抑制剂对5mg/L、10mg/L、15mg/L组进行处理,观察并记录药物治疗后斑马鱼幼虫心脏发育变化。所有数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,并用Graph Pad Prism 7制作统计图。结果:1.CsA处理后的斑马鱼与对照组相比自主运动降低,胚胎心脏发育畸形,心房心室分离,血液流速减慢并在卵黄囊处出现淤积,伴随着卵黄囊吸收延迟和水肿,5mg/L组与对照组相比未见明显区别（P＞0.05）,10mg/L组（P＜0.01）15mg/L（P＜0.001）组与对照组差异显著。药物处理组体长变短,尤其是15mg/L组与对照组有明显区别（P＜0.001）。同时药物处理组的斑马鱼幼虫出现明显的心包水肿、心率降低、静脉窦到动脉球的距离（SV-BA）加大,且与对照组相比具有明显差异（P＜0.001）。2.苏木精-伊红染色（HE）结果显示药物处理组的心包出现明显水肿,心房心室分离明显,激光共聚焦显微镜下可见药物处理组心肌与心内膜出现明显分离,与对照组心肌与心内膜贴合有显著差别,实时荧光定量PCR测定结果表明心脏发育相关基因gata4、nkx2.5、vmhc、klf2a表达紊乱,gata4、vmhc表达水平上调,而nkx2.5与vmhc表达水平下调。3.不同时间段环孢素A暴露结果显示在0hpf药物处理组与对照组未见明显差别,12hpf左右开始药物处理组开始出现心包水肿,心房心室分离,此外,随着治疗时间的延长,心包水肿逐渐增加,静脉窦与动脉球之间的距离也逐渐增加,48hpf进行首次药物处理时心脏发育毒性最为严重。4.环孢素A处理后的凋亡检测结果表明药物处理组的斑马鱼吖啶橙染色出现凋亡细胞增多现象,且随着药物浓度的增加而增加,与对照组相比具有显著区别,且凋亡基因P53、mdm2、bax的基因表达均出现显著上调。5.环孢素A处理后的氧化应激检测结果显示药物处理组ROS染色呈现绿色强荧光,且随着药物浓度的增加荧光加强,与对照组呈现显著差距,而氧化应激相关酶活性检测超氧化物歧化酶SOD出现表达下调,丙二醛出现明显上调,这表明CsA诱导的斑马鱼心脏发育毒性有氧化应激的参与。回救治疗结果表明抗氧化剂虾青素（ATX）的治疗有效,而且ATX回救组的ROS结果显示氧化应激水平下调,这进一步证明CsA诱导的斑马鱼心脏发育毒性有氧化应激反应的参与。6.检测wnt信号相关基因表达结果显示这些基因表达出现明显下调,且使用wnt信号通路抑制剂回救结果显示抑制剂回救组心包水肿得到明显改善,说明wnt信号通路参与CsA诱导的心脏发育毒性反应,但回救组的ROS染色结果呈现绿色强荧光反应,这表明wnt信号通路抑制剂的使用并没有使氧化应激水平下降,因此,我们推断wnt信号通路和氧化应激反应之间没有相互作用,CsA诱导斑马鱼心脏发育缺陷可能是通过上调的ROS和Wnt信号通路实现的。结论:1.环孢素A（CsA）诱导斑马鱼心脏发育毒性。2.环孢素A诱导斑马鱼心脏发育毒性在12hpf左右起效。3.环孢素A（CsA）诱导斑马鱼心脏发育毒性是氧化应激反应和wnt信号通路的共同作用实现的。