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猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪的一种急性肠道传染病,主要导致感染猪的腹泻、呕吐及脱水症状,对哺乳仔猪有很高的致死率,给世界养猪业造成巨大的经济损失。实验室现有的比较常用的PEDV诊断方法有免疫荧光、ELISA、免疫组化、RT-PCR等,但是这些方法操作费时且特异性、灵敏度不高,而且不能对疾病作出早期诊断,而荧光定量PCR则能够弥补这些缺陷,且可进行高通量检测。PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒,其基因组中的M基因特别保守,通常被用来作为检测方法的靶基因。我们参考GenBank中已经公布的PEDV CV777株,设计出扩增M基因全长的特异性引物,另外设计一对特异性引物及TaqMan探针,扩增长度为196bp的片段。利用RT-PCR技术,从阳性病料中扩增出681bp的M基因,序列比对结果表明,M基因序列与CV777株相应M序列的同源性高达98%,并且与已经发布的其它PEDV毒株的M基因序列相比,同源性也均在97%以上。我们将M基因克隆进pMD18-T载体中,将鉴定正确的重组质粒进行10倍梯度系列稀释以作为阳性标准品,从而建立了一种快速检测PEDV含量的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性及重复性进行测定。结果表明,反应模板的浓度和CT值呈良好的线性关系,建立的方程为y=-3.656gx+42.42,相关系数达到0.999,可检测出最低浓度为200copies/μL的PEDV反转录产物,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍。临床采集30份腹泻病料,用建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测出26份阳性,而常规RT-PCR仅检测出22份阳性。为了分析猪流行性腹泻病毒变异毒株FJ-9、YN-1、GD-01的致病性,本研究通过人工口服感染方式,将含有这3种变异毒株的病料各感染2头3日龄未食初乳的PEDV阴性仔猪,另设两头阴性对照仔猪。用荧光定量RT-PCR、HE染色、免疫组化等方法,评价了其在粪便排毒、组织病理损伤、病毒在猪体内分布及复制等情况。结果表明,攻毒仔猪在攻毒后(post-infection, PI)13-25h全部出现腹泻症状,并间或呕吐,严重脱水；在PI8-20h陆续在粪便中检测到PEDV阳性,并在此后一直保持较高的排毒量。剖检可见攻毒仔猪的病理变化主要表现在小肠和胃。肠管变薄,内含黄色水样粪便；胃膨胀,胃壁变薄,内含凝乳块。HE染色结果显示,攻毒组仔猪的小肠的肠绒毛明显缩短、变粗,固有层炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主；肠壁浆膜层变薄；绒毛上皮细胞呈立方状,部分空泡化,变性、坏死、脱落；另外肠绒毛杯状细胞增多；结肠和盲肠无明显的病理变化。另外,攻毒组仔猪的胃黏膜脱落,黏膜下层水肿,炎性细胞浸润。免疫组化结果显示,在攻毒猪的十二指肠、空肠、回肠、回盲瓣、结肠、胃内检测到阳性信号。病毒主要存在于小肠绒毛上皮细胞、隐窝上皮细胞和胃黏膜上皮细胞的胞浆内,结肠绒毛上皮细胞及小肠绒毛固有层内也有少量病毒存在。正常对照组仔猪的肠管等组织器官均未出现明显的病理变化,也未检测到病毒阳性信号。