骨髓组织中除了造血干细胞外，还存在一种非造血组织干细胞——骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs具有分裂、增殖、分化成多种细胞的潜能，在一定的体内或体外诱导条件下，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、星形胶质细胞和神经元细胞等。近年来，人们对骨髓MSCs与造血的关系及细胞治疗进行了广泛而深入的研究，间质干细胞已成为医学研究中的热点。由于MSCs免疫原性弱，且不表达MHC-Ⅱ和T细胞共刺激分子，这使异体MSCs在治疗应用中成为可能。但成人骨髓中MSCs含量极低，为得到足够数量MSCs应用于临床，需要体外培养、扩增和纯化。同时干细胞在长期培养过程中，可能会出现微生物污染或基因型改变等情况，为获得来源方便的间充质干细胞，开展有效的干细胞移植及建立干细胞库，需长期低温保存间充质干细胞。目前国内外尚未见深低温冻存对MSCs生物学特性影响的系统研究报道。本研究目的在于建立稳定的MSCs体外培养和扩增体系以及冻存最佳方案。研究分二部分：一、成人骨髓间充质干细胞体外培养、扩增及其生物学特性研究；二、低温冻存对成人骨髓间充质干细胞生物学特性影响的研究。 第一部分研究中，采用密度梯度离心贴壁培养方法。实验中观察到，梯度离心所得单个核细胞接种3～4h后细胞开始贴壁，24h内贴壁细胞数量增多，此后贴壁细胞数目不再增加，经过2—3天休眠期后，贴壁细胞开始分裂增殖，可见一些集簇形成，此时细胞多为梭形，1周后，贴壁梭形细胞体积增大，突起变长，少量细胞呈三角形或多角形，并开始迅速增殖，2周左右，细胞铺成单层，细胞排列成漩涡状、网状、辐射状，从形态上观察与成纤维细胞相似。虽在原代培养中可观察到一些圆形的造血细胞或内皮细胞贴壁生长，但经传代培养后，这些细胞不能再次贴壁，剩下的均为梭形细胞，因此MSCs得到纯化。细胞经多次传代，第8代细浙江大学硕士学位论文胞可扩增到(2一3) xlo’“。体外培养的Mscs绝大部分细胞(85%以上)处于G。/G1期，只有小部分细胞处于S十GZ+M期，表明间充质干细胞具有强大的增殖潜能。透射电镜显示MSCS胞质中有丰富细胞器，如核糖体、线粒体、粗面内质网、高尔基体等，提示该细胞具有较强的蛋白质合成功能，是其能够分泌许多生长因子维持自身生长分化、具多向分化潜能的结构基础。传代扩增细胞以流式细胞术检测，结果显示CD29、CD44、CD 166阳性标记出现单峰，CD14、CD34、CD45、HLA一DR均表达阴性，经5次传代细胞各表面抗原表达均无显著性差异(P>0.05)，证明所培养的MSCs是均一的细胞群，不含造血细胞，且多次传代后细胞表面标记表达稳定。 为进一步证明培养细胞的多向分化潜能，本研究应用成骨诱导分化剂、脂肪诱导分化剂和硫代甘油分别成功诱导MSCs向成骨、成脂肪和神经元细胞分化。在成骨诱导分化条件(含10一 SM地塞米松，10mMp一磷酸甘油，。.2mM抗坏血酸，10%FBs的D侧田M液)作用下，Mscs由单一的纤维状变成立方形和多角形细胞，细胞之间界限模糊，逐渐形成了多个散在的细胞结节，钙沉积逐渐出现，最终形成钙化结节。Von Kossa染色细胞外有大量钙盐沉积，广泛矿化结节形成。经脂肪诱导剂培养后油红O染色观察到大量橘红色脂肪细胞。经硫代甘油诱导神经元细胞后免疫组化结果显示神经干细胞标志物nestin、神经元标志物NSE、NF一M表达阳性，星性胶质细胞标志物GFAP表达阴性，表明诱导后细胞为神经元细胞而非星形胶质细胞。证实本研究体外分离培养、扩增的细胞是具有多向分化潜能的MSCs。 第二部分研究中，将体外扩增培养Pl细胞用含5%DMSO一30%FBS一DMEM冻存保护液重悬，细胞终浓度为1 x 106/ml，细胞分别用二步法和程控冻存方法冻存。二步法:细胞冷冻管置一70℃冰箱24h，然后直接移入一1%℃液氮罐内保存。程控冻存:将细胞冷冻管置程控降温仪中，以计算机设定程序降温，具体为以一1℃/min速率从4℃降至O℃，平衡smin，以一1℃/min速率降至一30℃，然后以一5℃/min速率降至一80℃，快速移入一196℃液氮罐保存。低温冻存3个月后40℃水浴快速复苏细胞、培养，探讨低温冻存对MSCs生物学特性的影响，比较二步法冻存和程控冻存方法的冻存效果。实验结果显示二步法冻存和程控冻存细胞复苏后台盼蓝拒染回收率(T BR)分别为79%士3.61%、87.67%士2.52%，两种冻存方法比较差异具显著性意义(t一3.414，作0.027)。冻存复苏后MSCs在体外培养的形态学变化与冻存前一致。应用MTI，法对不同冻存方法前后细胞进行细胞生长特性分析，结果显示二步法和程控冻存方法冻存后传代培养的早、中、晚(Pl、P4、P8)3代细胞与冻存前细胞一样经历潜伏生长期、对数生长期和平台期。冻存前后PS代细胞增殖能力均明显低于Pl、P4代细胞，差异具有显著性意义(P<0.01)。冻存前后相同代数细胞生长特性比较，程控冻存后复苏培浙江大学硕士学位论文养P4细胞第sd、6d以及PS代细胞从第4d起增殖能力较冻存前及二步法冻存细胞增强，差异具有显著性意义(尸<0 .05)。提示程控冻存后传代培养细胞增殖能力增强。流式细胞术检测冻?