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1目的采用队列研究的方法,探讨影响膝骨关节炎(KOA)患者终点事件发生的因素;运用数据挖掘技术挖掘KOA患者血小板计数(PLT)的变化及其与免疫炎症指标的关系,并探讨中医健脾单元疗法改善KOA的疗效;通过体外培养KOA患者外周血单核细胞,研究KOA患者细胞因子、血小板活化产物及VEGF/SDF-1/CXCR4信号通路的的变化,并基于VEGF/SDF-1/CXCR4信号通路探讨新风胶囊(XFC)含药血清抑制KOA患者血小板活化的机制研究。2方法2.1队列研究从安徽中医药大学第一附属医院病例系统中调取风湿科住院的KOA患者(时间:2016年10月-2018年6月)。用电话随访的形式,随访并记录患者出院后服用中药及终点事件发生情况。随后用Epidata 3.02软件建立我院KOA患者队列研究数据库,整理并上传随访资料。最后运用SPSS23.0软件进行统计学分析。2.2数据挖掘研究应用数据库软件为SQL Server,创立“安徽省中医院风湿科数据中心”,从中调取住院病人的一般资料、病程、中药使用情况及治疗前后实验室检查信息等情况。采用SPSS23.0及Clementine 11.1中的Aprior模块对数据进行处理分析。2.3体外实验研究制备高、中、低剂量XFC含药血清以备用。收集KOA外周血,分离PBMC。用MTT法检测XFC含药血清对PBMC的最佳抑制浓度和最佳作用时间。用ELISA法检测TNF-ɑ、IL-1、IL-4、IL-10、VEGFA、VEGFR2;RT-PCR法检测SDF-1、CXCR4、VEGFA、HIF-1ɑ基因表达;免疫荧光检测VEGFA、PDGF、CD40L的表达;Western-blot法检测VEGFA、VEGFR2、SDF-1、CXCR4蛋白的表达。3结果3.1 1100例KOA患者终点事件发生情况队列研究结果3.1.1终点事件情况随访期间四类终点事件发生总例数为89例包括全因死亡12例、再发入院45例、关节外病变12例和手术治疗20例。3.1.2中成药及中药使用情况随访期间,服用中药有院内制剂新风胶囊、黄芩清热除痹胶囊、五味温通除痹胶囊等。中药汤剂包括四妙散、桃红四物汤、独活寄生汤等。3.1.3终点事件与各指标间的Logistic回归中医药治疗是全因死亡(OR=0.552)、再发入院(OR=0.552)、关节外病变(OR=0.519)、手术治疗(OR=0.584)的保护性因素,年龄(OR=2.652)、ESR(OR=1.656)、PLT计数(OR=1.478)是全因死亡的危险因素,ESR(OR=2.206)、PLT计数(OR=1.431)、IgG(OR=1.509)是再发入院的危险因素,ESR(OR=1.854、OR=2.548)是关节外病变和手术治疗的危险因素。3.2 1203例KOA患者临床数据挖掘结果3.2.1 KOA患者PLT计数的变化1203例KOA患者PLT计数与正常值(100-300×10~9/L)相比较,上升的452例(占37.57%),相关性分析显示,PLT计数与ESR、hs-CRP、IgA、IgG、IgM、补体C3、补体C4呈正相关(P<0.01)。3.2.2中药使用情况1203例KOA患者住院期间使用中药共涉及300余味,使用频率最高的前20味中药,健脾化湿类:薏苡仁、茯苓、陈皮、山药、泽泻;清热解毒类:蒲公英、白花蛇舌草、黄芩、知母、甘草;活血化瘀类:桃仁、红花、鸡血藤、丹参、川芎;祛风除湿类:威灵仙、豨莶草、杜仲、伸筋草、独活。通过复杂网络及聚类分析亦可得出上述药物为治疗KOA的常用药物。3.2.3关联规则分析运用关联规则挖掘治疗KOA药物之间的关联,及指标与药物之间的关联,得出置信度最高的前三位的药对为:茯苓关联于薏苡仁(96.11%),桃仁关联于薏苡仁(91.42%)、蒲公英关联于薏苡仁(89.29%)。PLT计数下降下降与茯苓(95.58%),PLT计数下降下降与薏苡仁(95.18%),Ig M指标下降与薏苡仁(94.38%)。3.2.4中医健脾单元疗法对KOA患者PLT计数及免疫炎症指标的影响中药联合XFC在改善PLT计数、ESR、Ig A、Ig G、Ig M、补体C3水平上优于单纯中药组(P<0.01)。在随机行走模型中,中药联合XFC组的随机波动最大值、行走正向增长率、综合评价指标递增率、综合改善率等方面均优于单纯中药组,说明患者PLT计数、ESR、hs-CRP指标的改善与中医药治疗存在长程关系,中药干预时间越长,患者指标改善越明显。3.3体外实验研究结果3.3.1 XFC含药血清对PBMC的抑制作用XFC中剂量组含药血清在24h对PBMC为最佳抑制时间和剂量。3.3.2 XFC含药血清对KOA患者细胞因子及VEGFA、VEGFR2、PDGF、CD40L的影响与正常组比较,模型组TNF-ɑ、IL-1β、VEGFA、VEGFR2、PDGF、CD40L升高(P<0.01),IL-4、Il-10降低(P<0.01);与模型组相比较,各药物干预组TNF-ɑ、IL-1β、VEGFA、VEGFR2、PDGF、CD40L降低(P<0.01),IL-4、Il-10升高(P<0.01);与XFC组相比较,XFC+AMD3100组TNF-ɑ、IL-1β、VEGFA、VEGFR2、PDGF、CD40L降低(P<0.01),IL-4、Il-10升高(P<0.01),AMD3100组TNF-ɑ、IL-1β、VEGFA、VEGFR2降低(P<0.05,P<0.01),IL-4、Il-10升高(P<0.01);与AMD3100组相比较,XFC+AMD3100组TNF-ɑ、IL-1β、VEGF A、VEGFR2、PDGF、CD40L降低(P<0.05,P<0.01),IL-4、Il-10升高(P<0.01)。3.3.3 XFC含药血清对KOA患者SDF-1m RNA、CXCR4m RNA、VEGFAm RNA、HIF-1ɑm RNA的影响与正常组比较,各模型组SDF-1m RNA、CXCR4m RNA、VEGFAm RNA、HIF-1ɑm RNA升高(P<0.01);与模型组相比,药物干预后各组SDF-1m RNA、CXCR4m RNA、VEGFAm RNA、HIF-1ɑm RNA下降(P<0.05,P<0.01);与XFC组相比,AMD3100组和XFC+AMD3100组CXCR4m RNA、VEGFAm RNA、HIF-1ɑm RNA下降(P<0.01);与AMD3100组相比较,XFC+AMD3100组VEGFAm RNA、HIF-1ɑm RNA下降(P<0.01)。3.3.4 XFC含药血清对KOA患者VEGFA、PDGF、CD40L蛋白表达的影响倒置荧光显微镜下观察可见,VEGFA、PDGF、CD40L蛋白在正常组中呈现低表达,KOA患者中表达明显升高,经XFC、AMD3100、XFC+AMD3100干预后,可降低VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白的表达。3.4.5 XFC含药血清对KOA患者SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR2、MMP9蛋白表达的影响与正常组相比,模型组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR2、MMP9蛋白表达升高(P<0.01);与正常组相比,药物干预后各组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR2、MMP9蛋白表达降低(P<0.01);与XFC组相比,AMD3100组和XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR2、MMP9蛋白表达降低(P<0.01);与AMD3100组相比较,XFC+AMD3100组SDF-1、CXCR4、VEGFA、VEGFR2、MMP9蛋白表达降低更明显(P<0.01)。4结论KOA患者存在血小板计数升高,与免疫炎症密切相关,也是KOA终点事件发生的危险因素,健脾化湿通络中药可以降低血小板及免疫炎症水平。KOA患者血小板异常活化与VEGF/SDF-1/CXCR4信号通路的激活相关。XFC改善KOA患者血小板活化的机制及免疫炎症反应的具体机制如下:(1)通过上调抑炎因子(IL-4、IL-10)、下调促炎因子(TNF-ɑ、I-1β),降低免疫炎症反应,减轻关节破坏,缓解临床症状。(2)不但能够发挥类阻断剂样作用,且协同阻断剂阻断能更好地阻断VEGF/SDF-1/CXCR4信号通路,从而达到抑制血小板活化的目的,改善临床症状。