河弧菌(Vibrio fluvialis)是一种嗜盐革兰氏阴性兼性厌氧细菌,在海水、港湾水和河水中广泛分布,可使人类患河弧菌肠炎,主要病例表现为腹泻、恶心、呕吐等症状。河弧菌可产生许多致病毒力因子,比如金属蛋白酶、类肠毒素物质和溶血素等。一直以来,在国内,仅致病的霍乱弧菌、副溶血性弧菌等受到高度关注,而河弧菌并未受到相关部门的重视,但河弧菌引起的安全问题却不容忽视,因此开发一种快速检测河弧菌的方法具有重要的意义。目前,河弧菌的检测方法主要包括选择性鉴别培养基、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)、荧光抗体技术、环介导等温扩增技术、噬菌体诊断等技术,其中PCR方法是针对目的基因设计特异性引物,通过高温变性、低温退火及室温延伸一个周期,循环扩增,从而获得大量的目的基因,具有操作简便、快速等特点。荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative-PCR,qPCR)改进了普通PCR反应,在PCR反应中掺入荧光基团,通过实时监测荧光强度的变化,从而对PCR产物进行定量分析。但PCR方法的前提是模板的制备,从复杂的样品基质中提取DNA模板是目前研究人员所面临的难题之一,因此本研究拟采用免疫磁珠将河弧菌从样品基质中分离出来,再提取DNA,建立免疫磁珠结合荧光定量PCR检测河弧菌的方法。本研究主要内容如下:1.抗河流弧菌纳米抗体的表达及纯化通过基因工程手段,将抗河弧菌纳米抗体成功插入至表达载体pET25b-CTB,采用原核表达系统获取纯度较高的目的蛋白,并通过间接ELISA分析纳米抗体活性及特异性,结果表明,纳米抗体Nb70、Nb71、Nb72、Nb73、Nb74、Nb75均能与河弧菌结合,且Nb71与河弧菌结合的OD值均明显高于其他五株纳米抗体,且与其他细菌菌株无结合,特异性较好,采用加热法验证其稳定性,结果显示,Nb71在65℃加热60 min后,抗体依旧保持60%以上的活性,由此可见,Nb71具有较好的稳定性,因此选取Nb71进行后续实验。2.PEI-GA介导的免疫磁珠结合qPCR快速检测河弧菌方法的建立本研究建立了基于免疫磁珠富集并结合qPCR快速检测河弧菌的方法,利用加热洗脱法将河弧菌从免疫磁珠上洗脱后,SDS碱裂解法提取河弧菌DNA作为qPCR模板进行扩增,将CT值与不同浓度的河弧菌Ma2598绘制标准曲线,CT值与富集后不同浓度的河弧菌Ma2598呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.6777x+39.702,R~2=0.9901,最低检测限为48 cfu/mL,人工添加河弧菌Ma2598到鱼样及水样中后,对样品中添加的河弧菌Ma2598进行免疫磁珠捕获-qPCR检测,在鱼样中的最低检测限为4.8×10~2 cfu/mL,在水样中的最低检测限为48cfu/mL,结果表明,本研究建立的基于Nb71免疫磁珠结合qPCR检测河弧菌的方法在实际样本中具有的可行性。