当归(伞形科草本植物Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根),主要分布于岷县、云南和四川等地,是一种药食两用型传统中药,用于益气活血和调经止痛。研究显示,当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide;ASP),当归的主要生物活性成分之一,具有多种药理功效,包括生血、免疫调节和抗氧化等。本课题组近十多年来始终致力于当归多糖的提取纯化方法及相关生物活性研究。前期的初步探索发现,当归多糖可有效缓解2型糖尿病(T2DM)BALB/c小鼠的糖脂代谢紊乱,并且可一定程度地修复该疾病小鼠伴随的肝脏和胰岛损伤。遗憾的是,对于这些药效作用没有展开进一步研究。因此,本课题拟沿用实验室已确立的提取工艺,从岷县当归饮片中分离制备当归多糖;体内实验主要以高脂高糖(HFD)和链脲佐菌素(STZ)联合建立的T2DM小鼠的肝脏和胰岛为研究对象;体外实验以人肝癌细胞系HepG2和小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞系β-TC6为研究对象;旨在全面系统地解析当归多糖对T2DM小鼠肝脏和胰岛损伤的保护作用及机制(图1)。第一部分当归多糖ASP对2型糖尿病(T2DM)小鼠糖脂代谢的调节作用采用热水浸提法从岷县当归饮片中得到当归多糖水提液,水提液经pH调节、醇沉、干燥得到当归粗多糖,将粗多糖反复冻融、透析、葡聚糖Sephadex-G50凝胶柱分离、冷冻干燥最终得到水溶性白色絮状当归多糖ASP。硫酸-苯酚法、高效凝胶渗透色谱以及紫外扫描法检测依次发现,当归多糖糖含量为92.08%、相对分子质量为1.003×10~5 Da、基本不含蛋白质和核酸。本当归多糖性状产率稳定、纯度高、分子量均一,满足后续动物或细胞试验对其相关生物活性和药用价值研究的要求。采用HFD喂养BALB/c小鼠8周联合4次小剂量腹腔注射66 mg/kg STZ成功建立T2DM病理模型(空腹血糖水平(FBG)>11.1 mmol/L),之后给予当归多糖(100mg/kg)治疗4周。观察小鼠垫料发现,当归多糖治疗4周后T2DM小鼠的饮水量、尿液和粪便排泄量减少,即“三多一少”糖尿病典型症状明显缓解。血糖试纸检测FBG水平,结果显示T2DM小鼠经当归多糖治疗4周后高血糖症明显改善,FBG约从13mmol/L降低至7.7 mmol/L。测试小鼠口服葡萄糖耐量(OGTT),结果表明当归多糖可以提高T2DM小鼠的葡萄糖吸收和利用能力以及修复受损糖耐量。小鼠的血脂浓度检测结果显示,当归多糖可以降低甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平以及升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,从而明显缓解T2DM小鼠的血脂紊乱症状。本部分实验从当归饮片中提取、纯化得到当归多糖,并将该多糖用于HFD联合STZ诱导的T2DM小鼠的治疗。观察基本生理体征、检测糖代谢和脂质代谢相关指标,结果表明当归多糖可以明显改善T2DM小鼠的高血糖症和脂质代谢紊乱。第二部分当归多糖ASP对T2DM小鼠肝损伤的保护作用及机制研究小鼠当归多糖4周给药结束后:分离肝脏,称重,计算肝指数;形态学观察肝脏整体色泽和质地;组织学观察肝脏苏木素-伊红(HE)和油红O(ORO)染色切片;生化检测血清肝损伤因子谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性;以及免疫蛋白印迹(Western blot)法检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达。实验结果显示,当归多糖干预4周的T2DM小鼠的肝脏损伤程度明显减轻,主要体现在:(1)肝指数显著降低;(2)肝脏整体色泽由黄白逐渐恢复红润,质地变软;(3)肝细胞结构更完整、脂肪变性空泡和脂质堆积减少;(4)血清AST和ALT酶活力均明显下降;以及(5)促凋亡蛋白Bax表达显著减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显升高。生化法检测氧化应激相关指标,包括血清超氧化物歧化酶(SOD),肝脏过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽(GSH)以及过氧化产物活性氧(ROS)和丙二醛(MDA);酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清促炎因子TNF-α和IL-6水平,Western blot法检测肝脏炎性相关蛋白IKKα、p-IκBα和Nuclear NF-κB p65表达;Western blot法检测参与肝脏氧化应激、炎性应答以及细胞凋亡的信号通路蛋白SIRT1和AMPK表达;探讨当归多糖保护T2DM小鼠肝脏损伤的可能机制。实验结果表明,当归多糖(1)通过增强SOD和GSH-PX活性以及增加GSH含量,促进ROS和MDA的清除,从而缓解了T2DM小鼠肝脏的氧化应激压力;(2)通过减少血清TNF-α和IL-6水平,降低IKKα、p-IκBα和Nuclear NF-κB p65蛋白表达,从而抑制了T2DM小鼠肝脏的炎性应答反应;(3)可能通过激活SIRT1-AMPK信号通路从而发挥抗氧化抗炎活性。第三部分当归多糖ASP激活SIRT1-AMPK信号通路抑制HepG2细胞Nuclear NF-κB p65和ROS的表达MTT法检测当归多糖和油酸(OA)对人肝癌HepG2细胞活性的影响。结果显示,低于800μg/mL当归多糖诱导48 h不会使HepG2细胞活性明显增高或降低。0.4~0.5mmol/L OA孵育24 h可导致HepG2细胞的活性直线性显著下降,因此选择该浓度范围内OA刺激24 h可以诱导该细胞发生不同程度损伤。MTT法检测当归多糖(100、200和400μg/mL)对0.45 mmol/L OA诱导HepG2细胞活性降低的影响,结果表明当归多糖可剂量依赖地提高该HepG2细胞的活性。流式细胞分析仪和荧光显微镜检测当归多糖(100μg/mL)对0.45 mmol/L OA诱导HepG2细胞凋亡的影响,结果显示当归多糖可明显抑制HepG2细胞凋亡且抑制率超过50%。本实验结果证明了当归多糖具有直接的肝细胞保护生物活性。MTT法分别检测葡萄糖、EX527(SIRT1抑制剂)、Compound C(AMPK抑制剂)和SIRT1 siRNA对HepG2细胞活性的影响。结果显示,≤120 mmol/L葡萄糖(48 h)、≤160μmol/L EX527(24 h)、≤2μmol/L Compound C(24 h)以及≤200 nmol/L SIRT1siRNA(24 h)对该细胞的活性几乎没有影响。采用60 mmol/L葡萄糖(48 h)、10μmol/L EX527(24 h)、2μmol/L Compound C(24 h)或100 nmol/L SIRT1 siRNA(24 h)不同程度地抑制HepG2细胞的SIRT1和/或AMPK以及p-AMPK蛋白的表达,结果发现,伴随SIRT1-AMPK通路的抑制,ROS和Nuclear NF-κB p65的表达均明显升高。此外,将当归多糖加入上述几种SIRT1-AMPK信号受损的HepG2细胞体系培养48 h,SIRT1和/或AMPK、p-AMPK蛋白表达升高,ROS和Nuclear NF-κB p65的含量明显降低。体外实验结果验证了当归多糖对SIRT1-AMPK信号通路的激活作用以及该通路的激活抑制了由ROS和Nuclear NF-κB p65分别介导的氧化应激和炎性应答。第二部分和本部分内容系统完整地证明了当归多糖通过激活肝脏SIRT1-AMPK信号通路,抑制氧化应激和炎性应答,从而发挥了对T2DM小鼠损伤肝脏的保护作用(图2)。第四部分当归多糖ASP对T2DM小鼠胰岛功能的保护作用及机制研究小鼠当归多糖给药结束后,分离胰腺,制作胰腺HE染色切片,观察胰岛的形态和结构特征。结果显示,当归多糖干预4周可以明显缓解T2DM小鼠的胰岛结构破损程度。提取小鼠胰岛蛋白,Western blot法检测介导胰岛β细胞内外源性凋亡途径的主要蛋白的表达,包括Caspase蛋白酶家族成员(Cleaved caspase 8(p43和p18)、Caspase 9、Cleaved caspase 9(p39和p37)、Caspase 7、Cleaved caspase 7、Cleaved caspase6、Caspase 3、Cleaved caspase 3(p19和p17)和Cleaved PARP)以及Bcl-2蛋白酶家族成员(Bcl-2和Bax)。结果显示,当归多糖可以显著抑制T2DM小鼠胰岛Caspase家族级联反应相关蛋白的活化、降低Bax表达以及升高Bcl-2表达,表明当归多糖通过同时阻断内外源性凋亡程序,抑制了β细胞凋亡。ELISA法检测小鼠空腹血清胰岛素水平;免疫组化法检测空腹胰岛胰岛素含量;利用公式计算胰岛β细胞功能指数值HOMA-β。结果显示,接受当归多糖治疗的T2DM小鼠血清和胰岛的胰岛素水平均明显增加、HOMA-β指数明显提高,表明当归多糖可以改善T2DM小鼠胰岛胰岛素生产功能。第五部分当归多糖ASP保护β-TC6细胞损伤及机制研究MTT法探讨当归多糖和OA对小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞系β-TC6活性的影响。结果显示,低于800μg/mL当归多糖培养48 h不影响β-TC6细胞的活性;0.4~0.8mmol/L OA刺激24 h可导致β-TC6细胞活性不同程度地降低。MTT法和流式细胞仪分别检测当归多糖(400μg/mL)培养48 h对0.6 mmol/L OA诱导β-TC6细胞活性降低和凋亡的影响。结果显示,当归多糖可以明显阻止该细胞的活性抑制和凋亡发生,表明了当归多糖对β-TC6细胞的直接保护活性。Western blot法探讨当归多糖对抗0.6mmol/L OA诱导β-TC6细胞损伤的作用机制。同样地,检测了介导β-TC6细胞内外源性凋亡途径主要蛋白的表达,包括Caspase家族成员(Cleaved caspase 8(p43和p18)、Caspase 9、Cleaved caspase 9(p39和p37)、Caspase 7、Cleaved caspase 7、Cleaved caspase6、Caspase 3、Cleaved caspase 3(p19和p17)和Cleaved PARP)以及Bcl-2家族成员(Bcl-2和Bax)。结果显示,当归多糖通过抑制OA刺激的Caspase家族系列蛋白活化、增加Bcl-2蛋白表达以及减少Bax,阻断内外源性凋亡程序,从而减少了β-TC6细胞凋亡。此外,采用ELISA法检测β-TC6细胞应答2.5或16.7 mmol/L葡萄糖刺激分泌的胰岛素水平(GSIS测试),RT-PCR和Western blot技术分别检测该细胞胰岛素基因和蛋白的表达。结果显示,当归多糖可显著提高OA降低的β-TC6细胞应答葡萄糖刺激分泌的胰岛素水平以及增加胰岛素蛋白和基因的表达含量,表明了当归多糖对β-TC6细胞胰岛素生产能力的维持作用。本论文第四部分和本部分内容系统完整地证明,当归多糖通过阻断内外源性凋亡途径,抑制胰岛β细胞凋亡,从而促进了T2DM小鼠胰岛结构破损和胰岛素分泌功能障碍的修复(图3)。