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微量生物分子的准确可靠检测对于阐明各种生理和病理过程起着至关重要的作用，对于全球疾病管理和医疗系统的发展有着重大意义。近几十年来，研究者们已经提出了许多超敏生物传感检测平台，但对于复杂的实际样品中表达量极低的生物分子和本身比较活泼、难以捕获信号的活性分子的分析检测仍然面临巨大的挑战。电化学传感分析技术由于灵敏度高、操作简便、响应速度快、成本低且易于微型化等优点，成为生物分子检测常用技术手段。传感界面性质是影响电化学传感器灵敏度最为关键的因素，研究者们一方面引入不同结构的功能纳米材料对电极表面进行修饰以构建更灵敏、更稳定的传感界面，另一方面通过DNA纳米技术增强传感界面特异性、改善生物相容性、提升探针杂交速率，从而提高生物传感器的灵敏度。
石墨烯拥有高导电性、大比表面积和出色的机械性能等显著优点，被广泛应用于电化学生物传感界面的基底构建。但是，大多数粉体形式的石墨烯制备复杂、耗时，并且可能需要Nafion对电极表面的催化剂进行固定，减少了催化剂活性位点的暴露，导致检测效率降低。原位生长的三维石墨烯纳米材料可以克服粉体形式石墨烯的不足，保留自身优点的同时，还拥有丰富的电解液扩散通道、稳定性好、可重复性强等独特优势。因此，本文设计了基于三维石墨烯传感基底复合多种功能纳米材料协同作用的纳米敏感传感界面，并结合DNA纳米技术构建了具有高灵敏度、高稳定性和良好生物相容性的电化学生物分子检测平台，对microRNA、CEA、EVs、葡萄糖和过氧化氢这5种生物分子实现了定量分析检测，其中对miR-155的检测限低至23zM(2.3×10-20M)，并对细胞释放的H2O2实现了快速、原位、实时分析检测。具体研究工作如下：
①本研究采用两步电沉积法将聚吡咯-石墨烯/纳米金(PPy-rGO/AuNPs)纳米复合材料修饰于玻碳电极(GCE)和碳纤维纸(CFP)两种导电基底上，结合催化发夹组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)双重放大技术，构建无酶电化学生物传感器实现microRNA-16(miR-16)的高灵敏检测。PPy-rGO/AuNPs纳米复合材料构建的传感基底具有良好的导电性和生物相容性，其大比表面积有利于探针的固定。另外，CHA反应实现了无酶条件下目标链循环，达到信号扩大效果，HCR反应进一步实现了DNA链的扩增，使得大量的亚甲基蓝(MB)嵌入DNA的磷酸骨架中，通过检测MB的电化学信号从而实现靶标miR-16的定量检测。结果表明，所制备的两种不同导电基底的传感器对miR-16检测限(LOD)分别为1.57fM(GCE)和0.36fM(CFP)，其检测线性范围分别为10fM~5nM和1fM~500pM(6个数量级)。与GCE相比，CFP导电基底的三维交错纤维空间结构更有利于纳米传感界面的构建，具有更优的检测性能和检测限。
②基于上述研究，采用射频等离子体增强化学气相沉积法(RF-PECVD)将石墨烯片原位垂直生长于CFP纵横交错的碳纤维上，AuNPs通过电沉积技术均匀的负载在石墨烯墙(GWs)连续的三维骨架和壁上。该CFP/GWs/AuNPs(CAM)传感电极具有优异的导电性、丰富的溶液扩散通道和极大的比表面积，其独特的迷宫型结构对痕量的生物分子进行局部约束，增大了分子碰撞机率，从而提高分子结合效率。此外，引入的自组装DNA四面体纳米探针(DNA-T)具有良好的稳定性和机械刚性，从而保证了所固定生物探针之间的距离以及探针的取向，避免了探针互相缠绕，减少了空间位阻，有利于提高传感器的分析灵敏度和重现性。所构建传感平台实现了miR-155的单独检测，以及miR-155和miR-21双靶标的同时检测，其检测限低至0.023aM(23 zM)，该结果低于大多数现有电化学检测方法的检测限。采用该传感平台对30例临床血液样本中miR-155和miR-21进行分析检测，其结果与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果保持很高的一致性。表明所制备的CAM生物传感平台具有很高的灵敏度和可靠性，并且可以通过简单替换生物分子的特异性识别探针应用于多种不同的生物分子(核酸、蛋白、小分子甚至细胞)的定量分析检测。
③基于CAM生物传感平台，将DNA-T顶端延伸序列的发夹探针替换为敏感识别癌胚抗原(CEA )和细胞外囊泡(EVs )的适配体(DNA-T-AptCEA和DNA-T-AptEV)，构建了两种无标记的电化学生物传感器分别用于CEA和EVs的检测。在最优实验参数下，所构建的两种传感器在含有0.1MKCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中对不同浓度的CEA和EVs进行方波伏安检测(SWV)，根据SWV峰值电流响应变化实现CEA和EVs的定量检测，其检测限分别为0.46pg/mL(CEA)和1×103/mL(EVs)。并且在实际样本的CEA和EVs检测中，两种传感器均得到较为满意的检测结果，验证了所构建的CAM传感平台的普适性，具有多种不同类型的生物分子检测的应用潜力。
④除microRNA、CEA和EVs外，我们围绕CFP/GWs传感基底，通过高温下醋酸铜(Cu(CH3COO)2)的完全热分解将Cu2O纳米颗粒均匀的生长在三维的GWs层和骨架上，构建了具有高灵敏度的无酶葡萄糖传感器。CFP/GWs极大的比表面积负载了更多电催化剂(Cu2O)，且无需Nafion固定膜，可暴露出更多的催化活性位点，进而大大提高了传感器的电催化性能。所构建的CFP/GWs/Cu2O传感器对葡萄糖表现出来极佳的催化性能，其线性检测范围为0.5μM~5166μM，检测限低至0.21μM，响应时间<4s。特别地，由于Cu2O纳米颗粒通过简单的浓度调节可以精确定量地沉积在GWs上，使得传感电极具有高重现性和稳定性。另外，将检测结果同商业化血糖仪检测结果对比，检测结果一致，这表明所构建的传感器具有良好的准确性和可靠性。
⑤基于上述工作，本研究围绕GWs构建了活细胞直接生长的三维CC/GWs/AuPt生物传感界面对较活泼、信号难以捕捉、活细胞释放的H2O2进行快速、灵敏、原位、实时分析检测。同样采用RF-PECVD法在导电碳布(CC)上三维生长GWs，并将AuPt双金属颗粒电沉积于CC/GWs上，构建对H2O2特异催化的高灵敏传感界面。该CC/GWs/AuPt生物传感界面对H2O2的响应检测速度<5s，检测限低至0.084μM(84 nM)。另外，将细胞直接在CC/GWs/AuPt传感电极上进行培养，观察到细胞在CC/GWs/AuPt生物传感界面上生长状况良好，归功于CC/GWs/AuPt良好的生物相容性，为细胞的生长提供了有利于细胞的粘附/生长的三维微环境。在药物刺激下，该传感电极实现对细胞释放的H2O2原位实时检测。活细胞直接生长的传感界面大大缩短了细胞释放的待测物与传感界面的距离，大大提高了传感器的准确性和灵敏度，在进一步应用于细胞活动及其代谢产物的连续动态监测具有巨大潜力。
石墨烯拥有高导电性、大比表面积和出色的机械性能等显著优点，被广泛应用于电化学生物传感界面的基底构建。但是，大多数粉体形式的石墨烯制备复杂、耗时，并且可能需要Nafion对电极表面的催化剂进行固定，减少了催化剂活性位点的暴露，导致检测效率降低。原位生长的三维石墨烯纳米材料可以克服粉体形式石墨烯的不足，保留自身优点的同时，还拥有丰富的电解液扩散通道、稳定性好、可重复性强等独特优势。因此，本文设计了基于三维石墨烯传感基底复合多种功能纳米材料协同作用的纳米敏感传感界面，并结合DNA纳米技术构建了具有高灵敏度、高稳定性和良好生物相容性的电化学生物分子检测平台，对microRNA、CEA、EVs、葡萄糖和过氧化氢这5种生物分子实现了定量分析检测，其中对miR-155的检测限低至23zM(2.3×10-20M)，并对细胞释放的H2O2实现了快速、原位、实时分析检测。具体研究工作如下：
①本研究采用两步电沉积法将聚吡咯-石墨烯/纳米金(PPy-rGO/AuNPs)纳米复合材料修饰于玻碳电极(GCE)和碳纤维纸(CFP)两种导电基底上，结合催化发夹组装(CHA)和杂交链式反应(HCR)双重放大技术，构建无酶电化学生物传感器实现microRNA-16(miR-16)的高灵敏检测。PPy-rGO/AuNPs纳米复合材料构建的传感基底具有良好的导电性和生物相容性，其大比表面积有利于探针的固定。另外，CHA反应实现了无酶条件下目标链循环，达到信号扩大效果，HCR反应进一步实现了DNA链的扩增，使得大量的亚甲基蓝(MB)嵌入DNA的磷酸骨架中，通过检测MB的电化学信号从而实现靶标miR-16的定量检测。结果表明，所制备的两种不同导电基底的传感器对miR-16检测限(LOD)分别为1.57fM(GCE)和0.36fM(CFP)，其检测线性范围分别为10fM~5nM和1fM~500pM(6个数量级)。与GCE相比，CFP导电基底的三维交错纤维空间结构更有利于纳米传感界面的构建，具有更优的检测性能和检测限。
②基于上述研究，采用射频等离子体增强化学气相沉积法(RF-PECVD)将石墨烯片原位垂直生长于CFP纵横交错的碳纤维上，AuNPs通过电沉积技术均匀的负载在石墨烯墙(GWs)连续的三维骨架和壁上。该CFP/GWs/AuNPs(CAM)传感电极具有优异的导电性、丰富的溶液扩散通道和极大的比表面积，其独特的迷宫型结构对痕量的生物分子进行局部约束，增大了分子碰撞机率，从而提高分子结合效率。此外，引入的自组装DNA四面体纳米探针(DNA-T)具有良好的稳定性和机械刚性，从而保证了所固定生物探针之间的距离以及探针的取向，避免了探针互相缠绕，减少了空间位阻，有利于提高传感器的分析灵敏度和重现性。所构建传感平台实现了miR-155的单独检测，以及miR-155和miR-21双靶标的同时检测，其检测限低至0.023aM(23 zM)，该结果低于大多数现有电化学检测方法的检测限。采用该传感平台对30例临床血液样本中miR-155和miR-21进行分析检测，其结果与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测结果保持很高的一致性。表明所制备的CAM生物传感平台具有很高的灵敏度和可靠性，并且可以通过简单替换生物分子的特异性识别探针应用于多种不同的生物分子(核酸、蛋白、小分子甚至细胞)的定量分析检测。
③基于CAM生物传感平台，将DNA-T顶端延伸序列的发夹探针替换为敏感识别癌胚抗原(CEA )和细胞外囊泡(EVs )的适配体(DNA-T-AptCEA和DNA-T-AptEV)，构建了两种无标记的电化学生物传感器分别用于CEA和EVs的检测。在最优实验参数下，所构建的两种传感器在含有0.1MKCl的5mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中对不同浓度的CEA和EVs进行方波伏安检测(SWV)，根据SWV峰值电流响应变化实现CEA和EVs的定量检测，其检测限分别为0.46pg/mL(CEA)和1×103/mL(EVs)。并且在实际样本的CEA和EVs检测中，两种传感器均得到较为满意的检测结果，验证了所构建的CAM传感平台的普适性，具有多种不同类型的生物分子检测的应用潜力。
④除microRNA、CEA和EVs外，我们围绕CFP/GWs传感基底，通过高温下醋酸铜(Cu(CH3COO)2)的完全热分解将Cu2O纳米颗粒均匀的生长在三维的GWs层和骨架上，构建了具有高灵敏度的无酶葡萄糖传感器。CFP/GWs极大的比表面积负载了更多电催化剂(Cu2O)，且无需Nafion固定膜，可暴露出更多的催化活性位点，进而大大提高了传感器的电催化性能。所构建的CFP/GWs/Cu2O传感器对葡萄糖表现出来极佳的催化性能，其线性检测范围为0.5μM~5166μM，检测限低至0.21μM，响应时间<4s。特别地，由于Cu2O纳米颗粒通过简单的浓度调节可以精确定量地沉积在GWs上，使得传感电极具有高重现性和稳定性。另外，将检测结果同商业化血糖仪检测结果对比，检测结果一致，这表明所构建的传感器具有良好的准确性和可靠性。
⑤基于上述工作，本研究围绕GWs构建了活细胞直接生长的三维CC/GWs/AuPt生物传感界面对较活泼、信号难以捕捉、活细胞释放的H2O2进行快速、灵敏、原位、实时分析检测。同样采用RF-PECVD法在导电碳布(CC)上三维生长GWs，并将AuPt双金属颗粒电沉积于CC/GWs上，构建对H2O2特异催化的高灵敏传感界面。该CC/GWs/AuPt生物传感界面对H2O2的响应检测速度<5s，检测限低至0.084μM(84 nM)。另外，将细胞直接在CC/GWs/AuPt传感电极上进行培养，观察到细胞在CC/GWs/AuPt生物传感界面上生长状况良好，归功于CC/GWs/AuPt良好的生物相容性，为细胞的生长提供了有利于细胞的粘附/生长的三维微环境。在药物刺激下，该传感电极实现对细胞释放的H2O2原位实时检测。活细胞直接生长的传感界面大大缩短了细胞释放的待测物与传感界面的距离，大大提高了传感器的准确性和灵敏度，在进一步应用于细胞活动及其代谢产物的连续动态监测具有巨大潜力。