研究背景慢性乙型病毒性肝炎病毒(HBV)的感染是一呈世界范围内分布的、高感染率、对公共卫生造成极大威胁的的疾病。全世界大约有超过3.5亿的慢性乙肝病毒感染者(Chronic Hepatitis B virus, CHB),其中有部分患者已经进展为失代偿肝病、肝硬化、肝衰竭、原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)。人体一旦感染HBV,病毒是被清除还是机体处于持续感染状态要取决于病毒和机体的免疫系统之间的抗衡。在机体免疫系统清除病毒的过程中,细胞免疫,尤其是细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocytes, CTL)和CD4+Th(CD4+T helpercells)细胞发挥着重要的作用。经典理论将分化后的CD4+T亚群细胞根据其分化后分泌不同细胞的因子和功能分为Thl(T helper1, Th1)、Th2(Thelper2, Th2)和Treg(T regulation, Treg)亚群。其中Thl细胞是以分泌白介素2(Interleukin-2, IL-2)和干扰素-γ (Interferon gama, IFN-Y)为特征,后者在清除病毒过程中发挥着重要的作用,但是同时也对肝细胞造成了免疫损伤。Th2以分泌IL-4(Interleukin-4,IL-4), IL-5(Interleukin-5,IL-5), IL-6(Interleukin-6,IL-6), IL-10(Interleukin-10,IL-10)为特点,它们主要是发挥着炎症调节作用。有研究报道发现Thl和Th2之间的平衡在慢乙肝患者的疾病发展过程中影响着机体的免疫反应。近几年来,随着对免疫性相关疾病的深入认识,一种新的CD4+T细胞亚群Th17细胞也被发现。这类亚群的T细胞以分泌白介素17(Interleukin-17,IL-17)、白介素21(Interleukin-21,IL-21)和白介素22(Interleukin-22, IL-22)等为特点。其在慢性HBV感染过程中所发挥的免疫调节作用也逐渐被关注。已有相关研究报道发现Th17细胞及其相关的细胞因子的表达水平与慢乙肝患者的肝脏炎症、肝功能的损伤呈显著的正相关,如Th17细胞频数以及血清中IL-17水平与患者血清谷丙转氨酶(Alanine transaminase, ALT)之间有正相关性。并且通过免疫组化的方法发现二者在肝脏炎症部位有明显的聚集现象,即炎症越重二者聚集的越多。Th17细胞在分化成熟阶段需要外周细胞因子微环境和细胞自身信号的调节,其中IL-6与STAT3在此过程中发挥着重要的作用。相关研究报道发现慢乙肝患者随着疾病严重程度的加重,外周血中和肝脏炎症部位IL-1β,IL-6,IL-23等这些与Th17分化相关的细胞因子有明显增加的趋势。这些炎症因子的增加促进了Th17细胞的分化增殖,但是这些因子的作用需通过与细胞表面的受体结合然后活化STAT3,激活相关的靶基因从而发挥效应。对于慢乙肝患者外周血和肝脏炎症部位与Th17细胞分化相关的细胞的因子激活下游信号途径过程中有何种变化及发生变化的机制至今还是缺乏深一步的认识。研究目的1、比较轻中度慢性乙肝患者、重度慢性乙肝患者及健康对照人群的外周血中单个核细胞接受IL-6刺激前后CD3+CD4+T细胞IL-6R的表达水平。2、比较轻中度慢性乙肝患者、重度慢性乙肝患者及健康对照人群的外周血中单个核细胞接受IL-6刺激前后CD3+CD4+T细胞内的STAT3磷酸化水平。3、比较轻中度慢性乙肝患者、重度慢性乙肝患者及健康对照人群的外周血中单个核细胞接受IL-6刺激前后CD3+CD4+IL-17A+T细胞表达水平。4、分析外周血T细胞中CD4+T细胞表面IL-6R表达水平以及CD4+T细胞内STAT3活化水平与CD4+IL-17A+T细胞比例的相关性。5、分析外周血中CD4+T细胞内STAT3活化水平与血浆中HBV DNA水平,血清ALT水平的相关性。研究材料和方法1、样本来源从2011年9月至2012年3月就诊于广州南方医院的慢性乙型病毒性肝炎的患者,轻中度慢乙肝患者(Mild Chronic Hepatitis B, M-CHB)20例、重度慢乙肝患者(Severe Chronic Hepatitis B, S-CHB)20例。健康对照组(Healthy Control,HC)15例。上述患者住院前6个月内没有接受治疗,并且排除其他病毒性肝炎、肝癌、肝硬化失代偿、免疫相关性疾病、糖尿病等其他疾病。入组标准为轻中度患者血清TBIL<171μ M,PTA>40%,重度患者血清TBIL>171μ M,PTA<40%。15例健康人是南方医科大学在读本科生和研究生,并且没有其他疾病。2、样本血清学和病毒学检测用商品化的AxSYM MEI试剂盒(Abbot Laboratories, North Chiago, IL检测乙肝两对半、抗-HCV和抗-HDV。用罗氏Cobas Taqman18(Meylan,France)定量检测血浆中的]HBV-DNA,其最低检测下限为300cp/ml。此部分由南方医院肝病中心临床检测室完成。3、外周血单个核细胞(PBMC)的提取参考人群入组标准收集患者(健康人)外周静脉血(肝素钠抗凝,10ml)。使用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液,根据操作说明梯度密度离心提取外周血中的PBMC。4、CD3+CD4+IL-6R+T细胞表型标记收集新鲜的外周血后,提取新鲜的PBMC,每例样本分为刺激和对照组,取1×105细胞于无菌离心管200μ lRPMI1640(含10%FBS)培养基中放在培养箱中孵育1小时。然后标记相应的荧光素抗体,室温下避光孵育30分钟后用BDFACS Canto Ⅱ上机检测。5、CD3+CD4+T细胞内p-STAT3水平流式检测(Phosflow)收集患者(健康人)的外周血后,提取新鲜的PBMC,每例样本分为刺激(IL-6100ng/ml)和对照组,取1×105细胞于无菌离心管200μL1640(10%FBS)培养基中放在培养箱中孵育15分钟。固定破膜后标记细胞表面抗原(CD3、CD4)、p-STAT3的荧光标记抗体,室温下避光孵育1小时后用BDFACS Canto Ⅱ流式细胞仪上机检测。6、CD4+IL-17,A+T细胞胞内因子染色(ICS)收集新鲜的外周血后,提取新鲜的PBMC,每例样本分为刺激组(IL-6100ng/ml)和对照组,取1×105细胞于无菌离心管200μLRPMI1640(10%FBS)培养基中放在培养箱中孵育1小时。固定后标记细胞表面抗原(CD3、CD4)的荧光素抗体,破膜标记胞内因子IL-17A荧光素抗体室温下避光孵育30分钟后用BDFACS Canto Ⅱ上机检测。7、统计学分析所有数据均使用SPSS16.0统计软件进行分析,频数的比Wilcoxon-Mann-Whitney检验,相关性比较用Spearman’s相关性分析,所有结果均采用双侧检验,P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1、轻中度慢乙肝患者、重度慢乙肝患者及健康对照人群外周血中CI4+T细胞表面IL-6R的表达特点我们的研究结果表明,轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者外周血单个核细胞中CD3+CD4+T细胞表面的IL-6R的表达水平显著高于健康对照组,分别为M-CHB VS HC:1.4%(0.4%-4.4%) VS0.4%(0.1%-2.3%),P=0.004; S-CHB VS HC:1.8%(0-10.9%)VS0.4%(0.1%-2.3%),P=0.008。对每例样本PBMC给予人重组IL-6刺激培养后,发现慢乙肝患者组CD4+T细胞表面的IL-6R的表达水平与健康对照组之间没有明显的统计学差异(M-CHB VS HC:1.8%(0-6.9%) VS0.7%(0-3.8%), P=0.244; S-CHB VS HC:2.1%(0.5%-8.0%) VS0.7%(0-3.8%),P=0.047)。不管给予IL-6刺激与否,轻中度和重度慢乙肝患者人群的CD3+CD4+T细胞表面的IL-6R的表达水平没有明显的统计学差异(M-CHB VS S-CHB:1.4%(0.4%-4.4%) VS1.8%(0-10.9%), P=0.919; M-CHB-IL-6VS S-CHB-IL-6:1.8%(0-6.9%) VS2.1%(0.5%-8.0%), P=0.306)。对三组人群外周血单个核细胞给予IL-6刺激培养前后进行比较没发现CD4+T细胞表面的IL-6R表达水平没有有显著的统计学差异(HC-medium VS HC-IL-6:0.4%(0.1%-2.3%) VS0.7%(0-3.8%), P=0.858;M-CHB-medium VS M-CHB-IL-6:1.4%(0.4%-4.4%) VS1.8%(0-6.9%), P=0.776; S-CHB-medium VS S-CHB-IL-6:1.8%(0-10.9%), P=0.897)。与此同时,慢乙肝患者CD4+T细胞表面的IL-6R的表达水平与外周血中CD3+CD4+IL-17A+T细胞频数变化趋势一致(r=0.308,P=0.040)。2、轻中度慢乙肝患者、重度慢乙肝患者及健康对照人群外周血中CD4+T细胞内STAT3内活化水平的变化我们的研究发现,轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者基线水平下CD4+T细胞内p-STAT3内活化水平都明显高于健康对照组(M-CHB VS HC:0.15%(0-1%) VS0(0-0.1%),P<0.001;S-CHB VS HC:1.7%(0-14.8%) VS0(0-0.1%),P<0.001)。轻中度慢乙肝患者组和重度慢乙肝患者组之间也有显著差异(M-CHB VS S-CHB:0.15%(0-1%) VS1.7%(0-14.8%),P<0.001)。各组给予IL-6刺激培养后发现与基线水平有一致的趋势,即轻中度和重度慢乙肝患者组CD4+T细胞内p-STAT3内活化水平都明显高于健康对照组(M-CHB VS HC:45.7%(27%-59.6%) VS38.7%(26%-48.3%),P=0.029;S-CHB VS HC:46.7%(29.8%-67.6%) VS38.7%(26%-48.3%), P=0.029)。但是在体外给予IL-6对PBMC进行刺激培养后,M-CHB和S-CHB组之间没有明显的统计学差异(M-CHB VS S-CHB:45.7%(27%-59.6%)VS46.7%(29.8%-67.6%), P=0.571)。将各组进行IL-6处理前后比较,发现三组在处理后CD4+T细胞内p-STAT3内活化水平都明显高于各组的基线水平(HC-medium VS HC-IL-6:0(0-0.1%) VS38.7%(26%-48.3%), P=0.03; M-CHB-medium VS M-CHB-IL-6:0.15%(0-1%) VS45.7%(27%-59.6%),P<0.001; S-CHB-medium VS S-CHB-IL-6:1.7%(0-14.8%) VS46.7%(29.8%-67.6%), P<0.001)。3、慢乙肝患者组外周血Th17细胞频数的特点与之前的相关研究报道一致,在我们的研究人群中,轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者组外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数明显高于健康对照组(M-CHB VSHC：5%(0.7%-8.97%)VS1.2%(0.1%-2.9%),P<0.001；S-CHB VS HC：6.2%(1.3%-10.3%)VS1.2%(0.1%-2.9%),P<0.001)。外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数变化趋势与CD4+T细胞内的STAT3磷酸化水平一致(r=0.487,P=0.001)。当给予IL-6刺激培养后,轻中度患者组外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数明显高于健康对照组(M-CHB VSHC:6.6%(2.6%-11.4%) VS4.1%(0.6%-6.9%), P=0.001),但是重度组和健康对照组(S-CHB VSHC:5.0%(1.3%-15.4%)VS4.1%(0.6%-6.9%), P=0.161),轻中度和重度患者组之间也没有明显的统计学差异(M-CHB VS S-CHB:6.6%(2.6%-11.4%) VS5.0%(1.3%-15.40%),P=0.182)。健康对照组在接受IL-6刺激后外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数明显高于其基线水平(HC-medium VS HC-IL-6:1.2%(0.1%2.9%) VS4.1%(0.6%-6.9%),P=0.026)。但是慢乙肝患者组内都没有明显的差异,轻中度慢乙肝患者组(M-CHB-Control VS M-CHB-IL-6:5%(0.7%-8.97%) VS6.6%(2.6%-11.4%),P=0.088)；重度慢乙肝患者组(S-CHB-medium VS S-CHB-IL-6:6.2%(1.3%-10.3%) VS5.0%(1.3%-15.4%), P=0.460)。4、慢乙肝研究组外周血中CD4+T细胞内p-STAT3内表达水平与外周血T细胞中CD4+T细胞表面IL-6R表达水平、血清ALT水平以及血浆IBV-DNA水平之间的关系我们的研究结果表明轻中度慢乙肝和重度慢乙肝患者组外周血中CD4+T细胞内STAT3内活化水平与CD4+T细胞IL-6R表达水平(r=0.331,P=0.026)、血清中ALT水平(r=0.401,P=0.003)之间呈正相关性。外周血CD4+T细胞内p-STAT3内表达水平与HBV-DNA定量之间呈负相关(r=-0.403,P=0.02),表明STAT3的活化促进Th17的分化成熟诱发的炎症反应的同时对于病毒的控制也有一定的作用。结论1.轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者外周血中CD4+T细胞IL-6R的表达水平明显高于健康对照组；给予IL-6刺激后慢乙肝患者组外周血中CD4+T细胞IL-6R的表达水平与健康对照组没有明显的差异；三组处理前后没有明显的变化。2.轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者外周血中CD4+T细胞的P-STAT3表达水平明显高于健康对照组；给予IL-6刺激后慢乙肝患者组外周血中CD4+T细胞内的p-STAT3表达水平明显高于健康对照组；三组处理前后有明显的统计学差异。3.轻中度慢乙肝患者和重度慢乙肝患者外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数明显高于健康对照组；给予IL-6刺激培养后,轻中度慢乙肝患者组CD4+IL-17A+T细胞频数明显高于健康对照组；给予IL-6刺激培养后,健康对照组明显高于其基线水平。4.慢乙肝患者组外周血中CD4+T细胞IL-6R表达水平与其外周血中CD4+IL-17A+T细胞频数之间有着明显的正相关性；轻中度慢乙肝和重度慢乙肝患者组外周血中CD4+T细胞内p-STAT3内表达水平与CD4+T细胞IL-6R表达水平与CD4+IL-17A+T细胞频数、血清ALT水平呈正相关性,而与HBV-DNA定量之间呈负相关。