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热激蛋白70(heat shock protein70,HSP70)是逆境胁迫下诱导合成的一类功能型蛋白。HSP70遭受逆境胁迫时迅速合成,可稳定蛋白质和生物大分子结构,来提高植株抗逆性。研究表明,植物HSP70在响应逆境胁迫过程中起着重要作用。HSP70多以家族形式存在,在拟南芥、玉米、高粱、谷子、大豆等作物中均有相关的功能报道。然而,小麦中关于HSP70的研究较少。本试验旨在挖掘小麦HSP70基因家族成员,并对参与叶锈菌侵染小麦过程的HSP70成员进行功能分析。 首先,利用生物信息学方法获得25个小麦HSP70基因成员,通过与水稻HSP70蛋白家族成员构建系统进化树,结果显示其中有23个属于HSP70亚家族,2个属于HSP110亚家族。亚细胞定位预测结果显示HSP70亚家族的23个成员中11个基因定位于细胞质,2个定位于内质网,3个定位在叶绿体,7个在线粒体。 接着,选取TacHSP70-1,TacHSP70-2,TacHSP70-5进行表达分析研究,42℃热激0.5h后三者均表达量明显上调,表明小麦HSP70基因能够被高温诱导,符合热激蛋白受高温诱导的基本特性。当小麦分别接种亲和叶锈菌(生理小种165)和不亲和叶锈菌(生理小种260)后,TacHSP70-1,TacHSP70-2,TacHSP70-5三个目的基因表达量均有明显增加,且不亲和组合中基因表达高于亲和组合,表明三者均参与了小麦响应叶锈菌侵染的病理过程。进一步亚细胞定位结果显示三个基因均定位在细胞核和细胞质中,与生物信息学预测的结果相一致,同时揭示了HSP70在细胞中发挥功能的具体部位。 利用VIGS技术分别沉默TacHSP70-1、TacHSP70-2、TacHSP70-5,发现当将目的基因沉默后,在叶片接种叶锈菌后HMC数量增加并且HR面积也有所增加,表明小麦的抵抗能力降低。试验结果说明TaHSP70在小麦叶锈菌的防卫反应中起到正调控的作用。同时构建了RNAi和超表达载体,利用农杆菌侵染小麦幼穗,PCR检测转基因小麦,获得RNAi阳性植株8棵,超表达阳性植株6棵。 综上论文实验结果表明,小麦基因组编码25个HSP70基因成员,其中TacHSP70-1,TacHSP70-2,TacHSP70-5符合热激蛋白受热诱导的基本特性,且作为正向调节因子参与小麦对叶锈菌的防御反应。