苯扎氯铵为滴眼液中最常用的防腐剂，发挥抗菌防腐的作用。越来越多的动物试验及临床观察表明，苯扎氯铵对于眼表上皮具有损害作用。粘蛋白是眼表泪膜的重要组成成分，对维持眼表正常生理功能起着极其重要的作用。体外实验表明，重组人表皮生长因子促进大鼠气管上皮细胞粘蛋白的合成和分泌。本文进行了重组人表皮生长因子预防苯扎氯铵结膜上皮损害的实验研究。 第一章苯扎氯铵对人结膜上皮细胞毒性及粘蛋白表达影响的体外研究 目的：探讨苯扎氯铵对体外培养人结膜上皮细胞毒性及粘蛋白MUC1表达的影响。 方法：采用培养的3-5代人结膜上皮细胞，将不同浓度的BAC(0.01％，0.005％，0.001％，0.0005％，0.0001％)单次作用于结膜上皮细胞15分钟，分别于处理细胞后6，12，24，48，72小时MTT法检测细胞活力，于处理细胞后48小时固定，扫描电镜观察拍照。于处理细胞后0，6，12，24，48，72小时提取RNA及蛋白，采用RT-PCR及Westernblot方法检测MUC1表达水平。 结果：自BAC处理后6小时起，与对照组相比，各浓度BAC均使细胞活力下降(P<0.05)。经过72小时的恢复期，细胞活力未见恢复。随BAC浓度增高，细胞表面微绒毛消失，细胞出现不同程度收缩至脱落至大部分溶解坏死。0.01％，0.005％BAC作用后12至72小时可观察到结膜上皮细胞MUC1基因表达下调，0.001％，0.0005％BAC作用后，24至48小时出现MUC1基因表达的下调，72小时恢复。0.01％BAC作用后6至72小时检测到MUC1蛋白表达下降，而0.005％BAC作用后12至72小时MUC1蛋白表达下降，0.001％，0.0005％BAC作用后72小时MUC1蛋白表达减少。 结论：BAC对于培养的人结膜上皮细胞具有细胞毒性，并下调MUC1的表达，其细胞毒性具有剂量依赖性及不可逆性，对MUC1的下调作用具有时间依赖性和剂量依赖性。 第二章重组人表皮生长因子对人结膜上皮细胞BAC损害保护作用的体外研究 目的：探讨重组人表皮生长因子对人结膜上皮细胞BAC损害的保护作用. 方法：采用培养的3-5代人结膜上皮细胞，将BAC溶解于培养基中，终浓度为0.0005％。将rhEGF溶解于含0.0005％BAC中，终浓度分别为100ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，1ug/ml。单次作用于结膜上皮细胞15分钟，于处理细胞后48小时MTT法检测细胞活力。提取RNA，采用RT-PCR方法检测MUC1表达水平。于72小时提取细胞蛋白，Westernblot方法检测MUC1表达水平。 结果：加药处理后48小时，与对照组相比，0.0005％BAC，500ng/ml，1ug/mlrhEGF组MUC1mRNA表达水平下降。100ng/ml，200ng/mlrhEGF组MUC1mRNA表达水平无变化。与0.0005％BAC组相比，100ng/ml，200ng/mlrhEGF组MUC1mERNA表达水平显著提高。加药处理后72小时，与对照组相比，o.0005％BAC，500ng/ml，1ug/mlrhEGF组MUC1蛋白表达水平下降。100ng/ml，200ng/mlrhEGF组MUC1蛋白表达水平无明显改变。与0.0005％BAC组相比，100ng/ml，200ng/mlrhEGF组MUC1蛋白表达水平显著提高。加药处理后72小时，与对照组相比，0.0005％BAC及各浓度rhEGF均使细胞活力下降(P<0.05)。与0.0005％BAC相比，各浓度组rhEGF对细胞活力无提高。 结论：rhEGF对结膜上皮粘蛋白MUC1的表达具有调节作用，其调节作用可预防BAC诱导的结膜上皮细胞MUC1表达下降。 第三章重组人表皮生长因子对大鼠结膜上皮BAC损害保护作用的实验 研究一、大鼠结膜上皮BAC损害模型的建立 目的：建立大鼠结膜组织BAC损害模型。 方法：健康SD(Spraguedawley)大鼠30只，实验动物随机分为对照组，溶剂BSS组，0.5％BAC组，0.1％BAC组，0.05％BAC组，0.01％BAC组。每组5只。每天四次点眼。于用药后第七天处死大鼠后眼球取材，行结膜印迹细胞学检查，提取结膜组织RNA及蛋白，检测MUC1mRNA及蛋白表达水平。OCT固定结膜组织，冰冻切片，免疫荧光染色检查MUC1及MUC5AC表达水平。 结果：与对照组及BSS组相比，各浓度BAC组大鼠结膜杯状细胞数减少(P<0.05)，0.5％BAC组结膜杯状细胞几乎消失，MUC5AC蛋白表达减少。用药一周后，0.5％BAC组大鼠结膜组织MUC1mRNA表达水平下降，其余各浓度组及BSS组大鼠结膜组织MUC1mRNA表达水平无明显变化。免疫荧光结果显示，0.5％BAC组大鼠结膜组织MUC1蛋白表达水平下降，其余各浓度组及BSS组大鼠结膜组织MUC1蛋白表达水平无明显变化。 结论：BAC可引起大鼠结膜组织损害，结膜杯状细胞数量减少，滴用0.5％BAC-周后大鼠结膜组织MUC1表达下降。 二、重组人表皮生长因子对大鼠结膜组织BAC损害保护作用研究 目的：探讨重组人表皮生长因子对大鼠结膜组织BAG损害的保护作用. 方法：健康SD(Spraguedawley)大鼠30只，实验动物随机分为对照组，溶剂BSS组，0.5％BAC组，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF组，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF组，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF组。每组5只。每天四次点眼。于用药后第七天处死大鼠后眼球取材，行结膜印迹细胞学检查，提取结膜组织RNA及蛋白，检测MUC1表达水平，OCT固定结膜组织，冰冻切片，免疫荧光染色检查MUC1及MUC5AC表达水平。 结果：与对照组相比，0.5％BAC组大鼠结膜杯状细胞几乎消失(P<0.05)。与0.5％BAC组相比，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF组大鼠结膜杯状细胞数量增多(P<0.05)，MUC5AC蛋白表达增强。与对照组相比，0.5％BAC组MUC1mRNA表达水平下降，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF，0.5％BAC+50ug/mlrhEGF组大鼠结膜组织MUC1mRNA表达水平无明显变化。免疫荧光结果显示，0.5％BAC+10ug/mlrhEGF，0.5％BAC+20ug/mlrhEGF组大鼠结膜上皮MUC1蛋白增强，其中0.5％BAC+20ug/mlrhEGF与对照组最为接近。 结论：rhEGF可部分预防BAC引起的大鼠结膜组织损害，在mRNA及蛋白水平上上调MUC1表达，促进结膜杯状细胞的增殖，其最适浓度为20ug/ml。