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组氨酸激酶是双组份系统的重要部分,而双组份系统是真菌感受外界刺激的重要机制,它使真菌能适应和应答环境的改变。蝉花和蛹虫草是传统的药食两用真菌,通过对其组氨酸激酶基因的研究,在理论上比较同为它们的组氨酸激酶基因的表达调控差异。根据已知的蛹虫草组氨酸激酶基因(CmHK)的序列来设计引物,对蝉花组氨酸激酶基因IcHK进行克隆,克隆获得的序列经过测序、比对,最终获得了IcHK基因的开放阅读框(ORF)序列,全长为2811bp。对序列进行分析表明,IcHK基因可编码963个氨基酸残基,它的翻译产物IcHK有4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase_c功能域和1个REC功能域。长期以来,对组氨酸激酶的研究主要聚焦在它对外界信号的表达调控上,且近年来有关杀真菌剂表达调控的研究颇多。采用实时荧光定量PCR方法研究了三种杀真菌剂(咯菌腈、异菌脲和克菌丹)对蛹虫草组氨酸激酶CmHK和蝉花组氨酶激酶IcHK表达的影响。结果表明,CmHK基因和IcHK基因对这三种杀菌剂的敏感性均有所不同:这三种杀菌剂不能导致CmHK基因的相对转录量明显增加,因此CmHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响不敏感;而它们都可导致IcHK基因的相对转录量的增加,说明IcHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响都敏感,尤其对咯菌腈和克菌丹更为敏感。针对已获得的蛹虫草组氨酸激酶基因,设计两种方法来制备抗体,一种方法是通过原核表达CmHK基因的部分序列获得融合表达蛋白,并以此作为抗原制备抗体。依据CmHK基因ORF序列及其功能域分析,将其分为两段(CmHK1和CmHK2)分别设计引物,将PCR获得的CmHK1和CmHK2两个部分序列分别连接表达载体pET-41a(+),最终转化到BL21(Escherichia coli)受体细胞,以构建CmHK1和CmHK2的原核表达系统。利用IPTG诱导融合蛋白的表达,并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin纯化表达蛋白。纯化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作为抗原免疫家兔后获得了两种抗体anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一种方法是化学合成CmHK抗原决定簇短肽,偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体。化学合成三条短肽HK3、HK4和HK5后,分别与BSA偶联作为抗原制备了三种抗体anti-HK3、anti-HK4和anti-HK5。将这两种方法获得的抗体通过Western blotting方法检测CmHK在蛹虫草中的存在形式。Western blotting分析发现只有anti-CmHK2没有出现特异性条带,其他抗体均有特异性条带出现。在蛹虫草菌丝体中均可检测到两条特异的蛋白杂交带,分别为85 kDa和45 kDa,表明组氨酸激酶CmHK的可能存在形式有85kD和45kD两种。