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目的:探讨siRNA对体外人CD4+CD25-T细胞中MLL1基因表达的抑制效果,研究在MLL1基因表达减少的情况下,iTreg的诱导是否受到影响,为治疗与Treg失衡相关的免疫疾病提供理论基础。
方法:使用免疫磁珠分选方法从正常健康人外周血中分离出CD4+CD25-T细胞(纯度>85%)。针对H3K4甲基化起重要作用的MLL1基因SET区设计并合成了不同的siRNAs,分别为带绿色荧光的siRNA(siRNA-FAM)、三个实验组(siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3)与一个阴性对照组(siRNA-NC)。用脂质体法转染分选后培养24h的人CD4+CD25-T细胞。先转染siRNA-FAM,于转染后的6h,用荧光显微镜观察siRNA的转染效率,寻找最佳的转染条件。然后按照上述转染条件来转染siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3,siRNA-NC。于转染后的48h,每组取2×106个细胞,提取细胞内的RNA,然后逆转录为cDNA,用聚合酶链反应扩增该片段,用琼脂糖凝胶检测扩增后的DNA。在MLL1基因表达受到抑制的情况下,采用流式细胞术检测TGF-β1诱导72hiTreg的比例。
结果:当siRNA为100pmol,脂质体为5μl时,siRNA的转染效率达最高为(50.8±0.61)%。该实验条件下,发现实验组siRNA-2对MLL1基因mRNA较对照组有明显的消弱作用(F=5.82,P<0.05)。在MLL1基因表达削弱的情况下,TGF-β1诱导72hiTreg比例有明显的降低(F=4.046,P<0.05)。
结论:在本实验条件下,siRNA可以有效地抑制体外培养的人CD4+CD25-T细胞中MLL1基因的表达。阻遏MLL1基因的表达可有效地抑制TGF-β1对iTreg的体外诱导。