背景肿瘤的发生发展是肿瘤细胞与宿主免疫系统之间不断较量的结果。理论上，宿主免疫系统能监视并清除体内发生突变的细胞，但是体内的肿瘤细胞会利用包括共刺激分子表达下降、MHC分子表达异常、肿瘤抗原的免疫原性弱及抗原调变和肿瘤抗原诱导免疫耐受等多种途径抑制和逃避宿主免疫系统的监视与杀伤。其核心在于阻止肿瘤抗原提呈给效应细胞，使效应细胞不能有效执行监视和杀伤功能。T细胞介导的细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中起重要作用。机体主要借助细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)清除体内存在的少量瘤细胞，该效应在荷瘤早期、肿瘤缓解期或清除术后残余瘤细胞中发挥重要作用。若肿瘤增殖达一定程度并发生扩散，或至肿瘤晚期，此时患者处于免疫抑制状态，则自身免疫系统不能有效清除肿瘤。因此，同种异体T细胞治疗肿瘤受到越来越多的重视。肿瘤治疗的关键问题是如何诱导和激活有效的CTL。T细胞的激活需具备两种独立的刺激信号：第一信号是T细胞表面的特异性抗原识别受体(T cell receptor，TCR)和抗原呈递细胞(antigen-presenting cells，APC)上与MHC复合物结合的抗原相互作用；第二信号是由抗原呈递细胞上的共刺激分子和T细胞上相应受体的结合作用。双信号的结合使T细胞激活、增殖、分化为效应细胞。共刺激分子由APC和T细胞表面的黏附分子对(如B7／CD28、LFA-1／ICAM-1或ICAM-2、CD2／LFA-3等)的相互作用所提供，它们的结合还有助于维持、加强APC与T细胞的直接接触。在诸多黏附分子对中，最重要是T细胞上的CD28与APC表面相应配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的相互作用。特异性识别抗原和介导免疫应答的主要TCR aβ+T细胞，表面表达异源双聚a和β链。其互补决定区(complementarity-determining region，CDR)是TCR特异性识别抗原的区域，其中CDR1、CDR2均接触抗原肽与MHC分子的结合部位，而CDR3为高度可变区，接触抗原肽的中心部位。CDR3核酸序列呈高度多态性。不同T细胞克隆TCR重排时，其CDR3长度和碱基序列均不同，分析CDR3长度和序列是一种独特的检测T细胞克隆的方法。生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，结合二者可偶联抗原、抗体等大分子生物活性物质的作用。这种结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。利用具有高亲和力的生物素将嵌合分子CD80-链亲和素(CD80-SA)直接锚定到肿瘤细胞表面，使肿瘤细胞表达共刺激信号而激活T细胞，诱导出抗肿瘤免疫效应。随着分子免疫学和分子生物学研究技术的飞速发展，如免疫谱型分析技术等得到较为广泛的应用，给T细胞“发育、分化、调控”机制、T细胞“应答／耐受”等研究提供了新的方法。目的1．在本实验室建立监测人TCR aβT细胞CDR3谱系漂移的免疫扫描谱型分析技术(immunoscope spectratyping technique)，分析正常人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中TCR aβT细胞CDR3谱系的多态性和长度分布。为肿瘤、感染、移植等临床疾病的免疫应答机制、诊断、治疗研究提供新的思路和方法。2．白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)在体外具有促使所有亚型T细胞增殖及产生细胞因子(cytokine，CK)的作用，在T细胞体外培养中常规使用。研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移影响；用乳酸脱氢酶释放法检测其非特异性杀伤活性，以排除IL-2对后续实验的干扰。3．用失活的鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell，DC)激活T淋巴细胞，分析其对CNE2的特异性杀伤作用和T细胞TCRβ链CDR3谱型漂移。为同种异体肿瘤免疫治疗提供理论基础。4．恶性肿瘤细胞经常因缺乏共刺激信号，无法激活有效的抗肿瘤免疫反应，而逃避免疫系统监视。本实验利用具有高亲和力的生物素将嵌合分子CD80-链亲和素(CD80-SA)直接锚定到肿瘤细胞CNE2和CNE2／DDP表面，使肿瘤细胞表达共刺激分子，激活同种异体T细胞。研究蛋白修饰肿瘤细胞后转化为抗原提呈细胞的可能性。方法1．设计并合成人TCR aβT细胞24个TCR BV(TCRβchain variable gene)CDR3家族的上游引物、实验对照BC上游引物和共用的TCR BC (TCRβchain constant gene)下游引物(带FAM标记)。以健康志愿者PBMC为研究样本，按下列步骤分析CDR3：(1)提取总RNA；(2)逆转录为cDNA；(3)PCR扩增24 TCR BV家族。(4)扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳；(5)发现阳性带者进一步在373 DNA序列分析仪中电泳2h(6％变性聚丙酰胺测序胶)，GeneScan 672软件自动分析收获的数据。2．以健康志愿者PBMC和加入IL-2常用剂量体外培养5天的PBMC为研究样本，采用免疫谱型分析技术，分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性，研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移影响；用乳酸脱氢酶释放法检测其对CNE2的非特异性杀伤活性，以排除IL-2对后续实验的干扰。3．用GM-CSF、IL-4和TNF-a体外诱导健康志愿者外周血单核细胞，用丝裂霉素失活的CNE2负载，使之分化为成熟DC。流式细胞仪检测培养前后DC的表型特征。在IL-2的作用下，用负载CNE2抗原的成熟DC诱导自身T细胞生成特异性CTL。乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性；采用免疫谱型分析技术，分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。4．先将CNE2和CNE2／DDP生物素化，利用具有高亲和力的生物素将嵌合分子CD80-链亲和素(CD80-SA)直接锚定到肿瘤细胞CNE2和CNE2／DDP表面，使肿瘤细胞表达CD80。分离志愿者的T细胞，并与锚定CD80-SA的肿瘤细胞混合培养5d，激活同种异体T细胞，以乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性作用。结果1．5例健康志愿者PBMC中24个TCR BV CDR3家族的PCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶电泳图上显示一条模糊的条带；在6％测序胶凝胶电泳图上显示8条以上的条带，大小相差3bp；GeneScan软件分析显示24个TCR BV的CDR3谱型除BV19，均呈高斯分布(Gaussian distrution)，各家族的CDR3表达频率接近，但各家族呈现不同的CDR3多态性和长度分布。2．5例健康志愿者外周血T细胞对鼻咽癌细胞株CNE2没有非特异性杀伤作用；PBMC的TCR BV CDR3谱型除BV19，均呈高斯分布，但是T细胞在含有IL-2的无血清培养基中体外培养5d后部分家族出现不同的单克隆、寡克隆和偏峰现象，发生变化的家族存在个体差异，没有发现明显的规律性。3．健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF、IL-4和TNF-a诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC，其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用；PBMC的24个BV CDR3谱型除BV19，均呈高斯分布，而激活的CTL BV CDR3部分家族出现单峰、寡峰和偏峰，某些家族表达频率较高。表达频率较高的家族存在个体差异。4．利用蛋白锚定方法使鼻咽癌细胞株CNE2和其耐药株CNE2／DDP细胞膜有效地呈现外源性蛋白CD80-SA并诱导抗肿瘤免疫。流式细胞检测结果示：锚定前，CNE2和CNE2／DDP均不表达CD80；锚定后，表面的呈现CD80。乳酸脱氢酶释放法示：锚定的肿瘤细胞成功地激活了同种异体T细胞，两种细胞所激活的同种异体T细胞分别对CNE2和CNE2／DDP的有显著的杀伤作用。结论1．建立的监测人TCR aβT细胞CDR3谱系的免疫扫描谱型分析技术，是一种研究特异性T细胞的相对简便、可靠、灵敏度高的方法，可分析多克隆样本中CDR3表达频率的变化，并能筛选呈单／寡克隆增生的特异性T淋巴细胞。通过测序和生物信息学分析，可初步阐明相应T细胞克隆的TCR分子特征，同时可监测单克隆／寡克隆样本中CDR3的动态变化。该方法监测的是整个样品中T细胞的组成信息，并且不需对样本进行体外扩增等特殊处理。T细胞CDR3谱型分析可用到肿瘤、感染、移植、自身免疫病的T细胞应答机制、诊断、个体化治疗研究中。2．经IL-2体外培养的T细胞TCR CDR3基因扫描免疫谱型与培养前相比发生了变化，出现了单、寡克隆和偏峰，个别家族消失。发生变化的家族存在个体差异，没有发现明显的规律性。限制性使用的TCR BV家族可能与不同个体曾接触的抗原有关，是由记忆性T淋巴细胞被激活、增殖而出现的优势克隆。因志愿者未曾接触过鼻咽癌特异性和相关性抗原，所以对鼻咽癌细胞株CNE2的杀伤作用没有明显影响。研究结果提示：在TCR Vβ链CDR3的研究工作中有必要排除IL-2的作用，以免得出假阳性肿瘤相关优势克隆的结论。3．我们的前期工作证实：未经肿瘤细胞刺激的T细胞对CNE2没有杀伤作用。以灭活的鼻咽癌细胞株CNE2负载DC，DC高表达相对特异性表面标汜，并有诱导活化T淋巴细胞的能力。GeneScan分析显示：经肿瘤抗原诱导，三个志愿者T细胞TCR Vβ在排除IL-2对TCR Vβ的影响后，部分家族出现单峰、寡峰和偏峰图，个别家族消失，三个志愿者有明显个体差异。研究表明：该方法是一种有效且简便可行的DC修饰手段，并可以认为克隆性增殖T细胞与特异性CTL作用密切相关。4．研究显示：利用蛋白锚定技术使鼻咽癌细胞株CNE2和其耐药株CNE2／DDP细胞膜长时间呈现外源性蛋白CD80-SA，从而转变为有效的抗原提呈细胞，激活同种异体T细胞，在体外诱导出有效的抗肿瘤免疫。表明锚定上的CD80-SA具有生物学活性，能提供有效的共刺激信号，使T细胞增生并分化为杀伤细胞。简而言之，与其它基因转染技术相比，蛋白锚定技术快速、持久，为基础研究、临床治疗提供了安全、有效的方法。