女性恶性疾病中最常见的是乳腺癌,也是引起死亡的主要原因,仅在2008年,全球范围内就有138万新发确诊病例,有45. 84万患者死于该病。尽管医疗保健知识逐步提高、普查范围越来越广泛、治疗手段越来越先进,仍有20-30%的患者复发,5-7%的患者出现远处转移。虽然关于乳腺癌治疗方法越来越多样化,但是直到目前为止,其治疗的主要策略仍然以手术、化疗和放疗等传统方法为主。多西紫杉醇是乳腺癌治疗中最有效的化学药物,对于早期和进展乳腺癌来讲,含紫衫烷类的化疗方案是最标准的治疗方案。多西紫杉醇最初从欧洲水松的针叶中以前体形式存在的物质中分离获得,具有很强的疏水性,在静脉给药时需要助溶剂,其难溶性缺陷在很长的一段时间内限制了其临床应用。多西紫杉醇一般用聚山梨醇酯80(Tween 80)和乙醇稀释剂来助溶,再用生理盐水或5%葡萄糖溶液进行溶解静脉给药。助溶剂具有某些生物学和药代动力学活性,会对机体产生一些不良反应。Tween 80相关最常见的副反应是急性过敏反应和体液潴留,40%的患者出现相对较轻的反应,如面部潮红、心跳加速等,约有1.5-3%的患者发生威胁生命的呼吸困难、低血压等较重的副反应。其他的毒性反应还有嗜中性白血球减少症、周围神经病变等。多西紫杉醇可以作用于聚氯乙烯,浸出增塑剂,会引起严重的甚至是致命的过敏反应。因此多西紫杉醇给药需要特殊的注射器具,延长注射时间,给药前需要甾体类和抗组胺类药物的注射以防止过敏反应,因此高剂量的多西紫杉醇并不能提高疗效,反而会对正常组织产生较大的毒性。如何规避这些助溶剂的使用,避免不必要的副反应,并且能将更高剂量的药物高效递送到肿瘤部位,产生高效低毒的抗肿瘤效应的设想,促使了白蛋白纳米粒技术的诞生。白蛋白是分子量大小为66千道尔顿的血浆蛋白,是多种靶向药物递送的多功能载体。白蛋白也是机体内含量最大的血浆蛋白(35-50g/L血浆蛋白),是疏水分子的自然载体,具有与疏水分子非共价结合的特性。白蛋白在pH4-9范围内溶于水和乙醇,可以加热至60℃, 10个小时。白蛋白无免疫原性,具有很长的半衰期(平均19天),因此是药物递送最有潜质的载体。白蛋白纳米粒对于亲脂性药物是最理想的载体,多西紫杉醇与人血白蛋白在高压下结合成白蛋白药物纳米粒,粒径一般在100-200nm。多西紫杉醇和蛋白形成物理性质稳定的颗粒,平均粒径在130纳米左右的胶体状悬浮液,该颗粒具有疏水性内核与疏水性药物分子结合,周围是具有亲水性的外壳,由未变性人血白蛋白中的负电荷氨基酸组成。白蛋白纳米粒技术可以运输疏水性药物进入体内,不需要具有潜在毒性的溶媒,因此避免了给药前辅助用药来防止过敏反应的发生。纳米粒的优点还包括减少注射时间,也不用特殊的注射器具,因为不用担心聚氯乙烯注射用具中增塑剂的渗出,并且这种技术可以利用内源性白蛋白途径,使更大剂量的抗癌药物选择性递送到肿瘤部位。白蛋白可以结合肿瘤细胞表面的白蛋白受体糖蛋白60 (glycoprotein 60,gp60),激活gp60结合细胞内蛋白(小窝蛋白-1),通过细胞膜内陷机制,形成胞转小泡-细胞膜质膜胶囊,使白蛋白可以通过细胞转运机制,穿过内皮进入血管外空间。很多肿瘤细胞在其发展的不同阶段可以发生富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic rich in cysteine, SPARC)的表达水平显著升高,在恶性转化整个过程中,都伴随着SPARC的表达增加。肿瘤当中的SPARC过度表达和肿瘤较差的预后直接相关,有研究表明SPARC在45-65%的乳腺癌发展不同阶段中都呈过度表达状态。白蛋白可以特异结合乳腺癌肿瘤细胞表面的SPARC[5],白蛋白纳米颗粒向肿瘤的特异性递送,就是通过受体介导的胞吞转运作用以及特异性结合肿瘤细胞表面SPARC来实现的。有试验数据表明,紫杉醇白蛋白纳米粒同未经改造的紫杉醇相比,毒性降低、操作简化、药效提高、无用药前特殊处理,现已经开始进行单药和多药联合的一线治疗评价,以及包含非小细胞肺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤治疗方面的应用研究。因此,关于多西紫杉醇白蛋白纳米粒的研发也成为肿瘤靶向制剂的研究热点。国内外文献报道,紫杉醇白蛋白纳米粒技术已经日趋成熟,在临床试验中显示出非常出色的减毒增效的抗肿瘤效力。多西紫杉醇同属紫衫烷类药物,其抗微管解聚能力是紫杉醇的2倍,细胞内药物浓度是紫杉醇的3倍,相对药物毒性小,抗肿瘤疗效佳,且对耐药紫杉醇的细胞株也有一定活性,但多西紫杉醇白蛋白纳米粒技术仍停留在实验室研究阶段,仅见制备技术方面的零星报道。本实验室一直致力于多西紫杉醇白蛋白纳米粒的研发,取得了突破性的结果,已经获得该技术的国家专利,PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒的技术创新也属于领先水平,在国内外尚未见公开报道。本实验采用PEG化的人血白蛋白(HSA)通过乳化挥发交联法制备新型的PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒(PEG-DANPs),通过合成工艺的优化,获得最佳的载药量和包封率,电镜下纳米粒的粒径分布均匀,动态散射光法测定电位显示颗粒分散稳定,体外释放实验显示明显的缓释持续的药代动力学特征,适合药物在体内保持较高的浓度并发挥多重靶向作用。在体外实验中,MTT法和流式细胞仪检测显示PEG-DANPs比单纯多西紫杉醇和单纯多西紫杉醇白蛋白纳米粒DANPs更显著的抑制4T1细胞增殖和诱导4T1细胞凋亡的能力。细胞损伤愈合实验和Transwell法细胞侵袭实验,观察到PEG-DANPs显著的抑制4T1肿瘤细胞侵袭和转移的效果,RT-PCR法显示4T1细胞VEGF、MMP-9、C-met的mRNA表达在PEG-DANPs作用下显著下调,是影响4T1细胞侵袭转移的可能分子机制。用4T1-luc2建立的小鼠乳腺癌模型,可以通过活体生物发光技术动态实时观察瘤体生长和转移的客观情况。PEG-DANPs在乳腺癌模型上显示出与体内实验一致的显著抑瘤效果和抗转移效力,经过结构优化的PEG-多西紫杉醇白蛋白纳米粒在体内试验中,可以充分发挥主动和被动靶向作用,及多靶点的复合靶向作用来实现抗肿瘤效率的显著提升。本研究主要方法和结果:1、乳化挥发交联法制备PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒(PEG-DANPs)采用乳化挥发交联法制备PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒PEG-DANPs。制备的PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒易溶于生理盐水,并形成特征性的淡蓝色乳光。2、纳米粒电镜观察DANPs和PEG-DANPs均匀溶解于纯净水,透射电子显微镜下观察,白蛋白纳米粒呈均匀球形,粒径在160nm左右。3、动态光散射法测定PEG-DANPs的粒径和zeta表征PEG-DANPs 平均粒径是 158. 1±0. 2nm,zeta 电位平均为-17. 4±0. 6 mV。4、高效液相色谱法(HPLC)和高速离心法测定纳米粒的载药量和包封率纳米粒中的多西紫杉醇总量和包封率用HPLC法进行测定,其中的多西紫杉醇含量用HPLC进行测定。测得的PEG-DANPs的载药量和包封率分别为92. 9±0. 7%,8. 4±0. 6%。5、体外药物释放实验与单纯多西紫杉醇相比,PEG-DANPs显示缓慢持续释放的特征,这种药代动力学特征提示白蛋白纳米粒可以在机体血浆中长时间保持较高浓度,并显示更好的细胞毒性作用。6、MTT法测定纳米粒的抑制细胞增殖作用DT、DANPs、PEG-DANPs用MTT法测定的肿瘤细胞半抑制浓度分别为7.54±0.17μg/mL, 4.1089±0.05μg/mL, 3.0089±0.17μg/mL。DANPs 和 PEG-DANPs 同单纯DT在相同剂量下进行比较时,具有更显著的抑制细胞增殖作用(p<0.01) ; DANPs和PEG-DANPs对4T1乳腺癌细胞具有相似的浓度-时间依赖性抑制细胞增殖作用,两种药物抗肿瘤抑制细胞增殖能力有明显差异(p<0.05)。7、4T1肿瘤细胞爬片苏木素-伊红(HE)染色观察细胞爬片HE染色后在光学显微镜下观察,与对照组和单纯DT、DANPs组相比,PEG-DANPs组核固缩、核分裂更明显,细胞间距离更大。8、荧光显微镜观察4T1肿瘤细胞凋亡在荧光显微镜下进行观察,PEG-DANPs组可以观察到更多的晚期凋亡细胞。9、流式细胞术检测PEG-DANPs诱导细胞凋亡的作用和细胞周期阻滞作用三组治疗组比对照组诱导显著的细胞凋亡(p<0. 01),PEG-DANPs组比其他两个对照组可以诱导更多的晚期凋亡(p<0. 01)。三组治疗组比对照组显著抑制细胞增殖(p<0. 01),PEG-DANPs组可以观察到比其他两个治疗组更高比例的G2/M期细胞周期阻滞(p<0. 05)。10、 体外损伤愈合实验和Transwell法评价纳米粒抗4T1肿瘤细胞侵袭能力治疗组和对照组相比明显延缓损伤愈合(p<0. 01),PEG-DANPs组比其他两个治疗组具有更显著的抑制细胞迁移作用(p<0. 01)。治疗组与对照组相比显著抑制细胞穿膜能力(p<0. 01),PEG-DANPs组比其他两个治疗组作用更显著(p<0. 01)。11、 RT-PCR 法检测 4T1 细胞中 VEGF、MMP-9、C-met 的 mRNA表达三组治疗组的表达要显著低于对照组,PEG-DANPs组比DT和DANPs组的下调作用更为显著。12、 4T1-luc2侵袭性乳腺癌生物发光模型的制备及评价调整细胞浓度为高、中、低三种接种浓度,分别为1.0×106/只、1.0×105/只、1.0×104/只。三组乳腺癌自发转移模型均在第2d可以检测到4T1-luc2细胞的荧光信号,荧光信号增强与接种细胞的浓度和接种时间成正相关,即细胞浓度越高,时间越长,荧光信号强度数值越高。三组出瘤时间不同:高浓度组9d,中浓度组:11d,低浓度组:16d,可以观察到肉眼可见的肿瘤。调整细胞浓度1.0×105/只,分为正常组,对照组和紫杉醇组,紫杉醇组给药后肿瘤生长缓慢,荧光信号较对照组明显减弱,与肿瘤生长情况相符。13、 生物发光法动态观察4T1侵袭性乳腺癌分对照组、DT组、DANPs组和PEG-DANPs组,检测到各组小鼠生物发光的平均强度(量子/秒/毫米),与肿瘤的生长和转移呈时间依赖性增强。在第32d时,各组进行比较,三组治疗组与对照组相比,生物发光强度显著降低(p<0. 01) ; PEG-DANPs和DANPs显示出了显著的抗肿瘤转移效力,生物发光强度显著减少(vs Control和DT组,p<0. 01),而单纯多西紫杉醇治疗组则出现了多处的脏器转移,包括肺、肝、心脏、和骨,该结果经组织化学染色验证;PEG-DANPs组表现出了明显的抗转移能力,没有重要脏器的转移,其发光强度也较DANPs组明显减低(vs DANPs组,p<0. 05)。14、 小鼠乳腺癌肺转移、死亡时间的观察三个治疗组比对照组显著降低肺转移发生(p<0.01) PEG-DANPs较其它组显示出明显的抗肺转移的能力(vs DANPs组,p<0.05,与其他两组比较,p<0.01),对照组肺转移结节几乎长满,PEG-DANPs组几乎没有肺癌转移结节,而单纯DT和DANPs组均有不同数量肺转移结节。对照组小鼠在37.17±1.25d时全部死亡,而PEG-DANPs小鼠在56.50±2.03d全部死亡,经PEG-DANPs治疗,可以获得比其它组更长的生存时间(vs Control和DT组,p<0.01, vs DANPs组,p<0.05)。研究结论:1、用mPEG-HSA成功制备了 PEG化多西紫杉醇白蛋白纳米粒(PEG-DANPs),粒径均匀,性质稳定,体外释放实验显示具有缓慢、持续释放的药代动力学特征。2、体外实验中,PEG-DANPs具有更强的细胞毒性作用,能显著抑制4T1细胞的增殖和诱导晚期凋亡。3、PEG-DANPs显著降低4T1肿瘤细胞的VEGF、MMP-9和C-met的mRNA表达,抑制其侵袭和转移能力。4、成功构建了 4T1-luc2转移性乳腺癌模型,活体生物发光技术可动态监测活体动物肿瘤进展情况,实现敏感的,无创伤性,动态观察肿瘤生长的途径。5、PEG-DANPs显著抑制4T1-luc2转移性乳腺癌模型中的肿瘤生长、减少肺转移的发生,延长生存时间。