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在牙髓生物学领域，骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)促进成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成，在牙体牙髓的损伤修复中发挥重要调控作用，在保髓治疗中前景远大。本课题组前期研究证实，腺病毒介导的BMP-7基因转染人牙髓细胞(human Dental Pulp Cells，hDPCs)可诱导牙髓细胞碱性磷酸酶活性的增强，并提示其诱导成牙本质细胞分化。骨形成蛋白生物学效应的分子机制涉及两条重要的信号通路：Smads蛋白依赖性和Smads蛋白非依赖性信号转导途径。Smads蛋白依赖性信号转导途径由靶细胞膜上BMP受体及细胞质内各型Smads蛋白协同参与完成，是TGF-β超家族包括BMPs信号转导的经典通路，是近年来研究的热点。本实验拟检测hDPCs膜上BMP受体的表达，同时观察重组人BMP-7((recombinant human Bone Morphogenetic Protein-7，rhBMP-7)对牙髓细胞碱性磷酸酶活性的调控作用，研究rhBMP-7信号作用下BMP通路相关受体调节型Smads蛋白的表达变化趋势及细胞内定位，探讨经典Smads信号通路在BMP-7调控人牙髓细胞碱性磷酸酶活性的作用，以了解生长因子BMPs的信号调控机制。
目的：
本研究采用体外分离培养的人牙髓细胞作为实验模型，检测牙髓细胞膜上BMP受体的表达，利用rhBMP-7和BMP信号抑制剂Noggin研究BMP信号对牙髓细胞ALP活性的影响，并观察在BMP-7及Noggin作用下Smads信号蛋白的表达变化趋势及胞内定位，探讨BMP/Smads信号转导通路在调控人牙髓细胞内碱性磷酸酶活性中的作用。
材料和方法：
①收集因正畸治疗需要拔出的年轻健康完整恒牙，Ⅰ型胶原酶消化组织块法原代培养hDPCs，取第5代hDPCs采用MTT比色法测定细胞生长曲线：免疫组织化学方法进行波形丝蛋白和角蛋白的免疫染色，鉴定细胞组织学来源；Von Kossa染色检测传代后人牙髓细胞的矿化分化特性。②取第3代hDPCs，以200ng/mLrhBMP-7连续培养10天，ALP检测试剂盒检测其对牙髓细胞ALP活性的影响，并以等剂量的BMP信号抑制剂Noggin进行BMP信号阻断，同时检测牙髓细胞内ALP活性。③取第5代hDPCs，采用SABC法检测hDPCs膜上：BMP两型受体BMPR-IA、BMPR-IB和BMPR-Ⅱ的表达。④取第3代hDPCs，采用免疫荧光技术检测rhBMP-7刺激前后信号蛋白Smadl/5的细胞内定位，荧光显微镜下观察Smadl/5蛋白的核转位情况。⑤取第3代hDPCs，实验组在200ng/mL rhBMP-7分别刺激0min、15min、45min及120min采用Western blot免疫印记法检测磷酸化Smad1/5(P-Smad1/5)、Smad1/5的蛋白表达水平及变化趋势。抑制剂组用等剂量的Noggin预处理45min后加入rhBMP-7，继续孵育45min，Western blot检测P-Smad1/5和Smad1/5蛋白的表达。
结果：
①本研究采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞，成功培养出hDPCs，牙髓组织块经消化后接种约4～6天，可见细胞从组织块周围呈辐射状爬出，一般2周左右出现汇合，可进行传代；MTT结果显示细胞具有较强的增殖活性，细胞1～3d生长相对缓慢，处于缓慢生长期，第3～6天进入对数生长期，细胞数量持续升高，第6天以后生长相对缓慢，细胞生长进入平台期。细胞来源鉴定结果显示，体外培养的牙髓细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，提示细胞来源于间叶组织，无上皮成分混杂，符合牙髓组织学特征。经连续培养4周后，牙髓细胞形成矿化结节，Von Kossa染色阳性，提示传代后的牙髓细胞具有一定矿化分化潜能。②rhBMP-7连续培养lO天，牙髓细胞内ALP活性增强，而预先阻断BMP信号通路可出现ALP活性被抑制的效应。③免疫组织化学结果显示，hDPCs细胞膜和细胞质。BMP受体BMPR-IA、 BMPR-IB及BMPR-Ⅱ呈阳性表达。④未受到rhBMP-7刺激时，Smad1/5绿色荧光主要分布在在细胞质，胞核内几乎无荧光可见。rhBMP-7刺激后，绿色荧光丰要出现在细胞核内，细胞质内蛋白呈弱阳性表达，Smad1/5蛋白呈现由胞质到胞核转位的趋势。⑤Western blot免疫印记结果显示，在所观察的时间点，磷酸化Smad1/5(P-Smad1/5)随rhBMP-7作用时间的延长而表达渐强，其表达高峰出现在作用后的第45min，之后表达减弱。Smad1/5在BMP-7作用2小时内表达未见明显变化。阻断BMP信号通路后，磷酸化Smad1/5的表达受到抑制，Smad1/5的表达变化未见明显差异。
结论：
体外培养的人牙髓细胞存在BMP受体BMPR-IA、BMPR-IB及。BMPR-Ⅱ的表达；BMP-7可提高牙髓细胞内碱性磷酸酶表达活性，信号分子Smad1/5参与了BMP-7在牙髓细胞内的信号转导，对牙髓细胞的分化指标碱性磷酸酶活性具有调控作用。本实验为进一步研究BMP-7诱导牙髓细胞向成牙本质细胞分化的分子机制提供了实验依据；同时，利用对特异性信号通路进行调控以诱导牙髓牙本质复合体损伤后修复，为进行临床保髓治疗策略提出新的思路。