背景：糖尿病血管病变严重，发病年龄轻，进展快，累及范围广，并且伴有严重的侧支动脉发育受损，是造成糖尿病死亡的主要原因。内皮祖细胞(EPC)是骨髓干细胞的一种亚群，是血管内皮细胞的前体细胞，不仅在血管新生中作用显著，也有强烈的内皮保护作用。成年人体内存在骨髓内皮祖细胞(BM-EPC)和循环内皮祖细胞(circulating EPC)，后者又具有两种亚型，循环早期内皮祖细胞(early EPC)和循环晚期内皮祖细胞(late EPC)。研究发现，无论是1型还是2型糖尿病，其内皮祖细胞的增殖、黏附、整合入血管结构以及成血管能力均显著下降，糖尿病血管病变与其内皮祖细胞功能不全密切相关。然而糖尿病影响内皮祖细胞功能的机制、糖尿病对不同来源内皮祖细胞功能影响是否存在差别、内皮祖细胞移植是否会改善高糖环境下缺血心肌的灌注等远未明确。目的：1．探讨BM-EPC和late EPC的生物学特征差异。2．探讨高糖、高胰岛素对体外培养的BM-EPC和late EPC增殖以及血管内皮细胞生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA表达的影响。3．探讨四氧嘧啶诱导的糖尿病对兔BM-EPC和late EPC集落形成能力以及增殖和黏附功能的影响。4．探讨糖尿病来源的BM-EPC和late EPC心肌内移植对四氧嘧啶诱导的糖尿病兔急性心肌梗死的修复作用。方法：1．分别抽取健康兔骨髓4ml和外周血10ml，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF的DMEM／DF12或M199培养液中培养BM-EPC和late EPC；流式细胞仪检测两种细胞的细胞表面标志CD14、CD34、CD45、CD54、CD105、CD106、CD133、KDR和vWF的阳性率；激光共聚焦显微镜检测两种细胞吞噬ac-LDL以及结合UEA-1的能力。2．收集健康兔来源的P2代BM-EPC和late EPC，分为5组：对照组(5.5mmol／l葡萄糖)，glucose11组(11mmol／l葡萄糖)，glucose30组(30mmol／l葡萄糖)，ins100组(100nmol／l胰岛素)，ins1000组(1000nmol／l胰岛素)，采用不同浓度的葡萄糖和胰岛素刺激。MTT法检测刺激48小时和96小时后两种细胞的增殖能力。RT-PCR法检测两种细胞在接受高糖、高胰岛素刺激96小时后VEGF和bFGF mRNA表达的水平。3．四氧嘧啶诱导兔糖尿病模型后4周，培养糖尿病组(n=6)和对照组(n=6)动物BM-EPC和late EPC。分别检测原代培养的两组BM-EPC和late EPC集落形成数，以MTT法检测细胞增殖，并检测细胞对纤维连接蛋白的黏附能力。4．四氧嘧啶诱导糖尿病模型后将动物分为对照组(n=8)，骨髓内皮祖细胞移植组(n=8)和循环晚期内皮祖细胞移植组(n=8)。糖尿病造模6周后结扎动物前降支造成急性心肌梗死模型，之后于对照组心肌内注射M199培养液200μl，骨髓内皮祖细胞移植组注射BM-EPC 5×10~6，循环晚期内皮祖细胞移植组注射late EPC 5×10~6。以激光共聚焦显微镜观察移植细胞的分布；以Masson三色染色法检测细胞移植后心肌纤维化面积；以Ⅷ因子免疫组化法标记毛细血管，计算毛细血管密度；以心脏超声观察心功能的改变；以实时定量PCR检测VEGF和bFGF的表达。结果：1．BM-EPC与late EPC CD14，CD54，CD105，KDR，vWF阳性率无差异(P＞0.05)；BM-EPC CD45，CD133阳性率高于late EPC(P＜0.05)；BM-EPC的CD34和CD106阳性率低于late EPC(P＜0.05)；两种细胞都能吞噬ac-LDL并结合UEA-1，吞噬ac-LDL的能力相当(P＞0.05)。2．高糖刺激48小时对BM-EPC增殖功能无明显影响(P＞0.05)，刺激96小时后11mmol／l的葡萄糖促进BM-EPC的增殖(P＜0.05)，而30mmol／l葡萄糖与对照组无明显差别(P＞0.05)。高糖刺激48小时后，随着葡萄糖浓度的增加，late EPC增殖能力逐渐减弱(P＜0.05)；刺激96小时后葡萄糖仍呈浓度依赖性抑制late EPC增殖，glucose11组增殖能力较对照组明显下降(P＜0.05)，glucose30组不但较对照组(P＜0.01)也较glucose11组(P＜0.05)明显下降。胰岛素刺激48小时可以促进BM-EPC的增殖，ins100组和ins1000组细胞增殖均较对照组增高(P＜0.05)；而随着培养时间的延长胰岛素的促增殖作用则逐渐减弱(P＞0.05)。高胰岛素刺激48小时抑制late EPC细胞增殖，ins1000组细胞增殖较对照组(P＜0.01)和ins100组(P＜0.05)明显降低；高胰岛素刺激96小时后各组细胞增殖无明显差别(P＞0.05)。高糖对BM-EPC的VEGF mRNA表达无明显影响(P＞0.05)，却剂量依赖性地抑制late EPC的VEGF表达，glucose11组和glucose30组VEGF的表达均较对照组降低(P＜0.01)。与对照组比较，11mmol／l葡萄糖刺激促进BM-EPC表达bFGF(P＜0.01)，但30mmol／l葡萄糖刺激则抑制bFGF的表达(P＜0.01)。葡萄糖呈剂量依赖性地抑制late EPC表达bFGF(ins100组vs对照组P＜0.05，ins1000组vs对照组P＜0.01)。胰岛素对BM-EPC表达VEGF无影响(P＞0.05)，1000nmol／l胰岛素抑制BM-EPC表达bFGF(P＜0.05)。胰岛素抑制late EPC表达VEGF和bFGF，ins100组和ins1000组VEGF和bFGF表达均较对照组降低(P＜0.05)，两组之间无差别。3．四氧嘧啶诱导的糖尿病组和对照组兔BM-EPC的集落形成能力以及细胞增殖、黏附能力无差别(P＞0.05)。与对照组比较，糖尿病组late EPC集落形成数量减少(P＜0.05)，细胞增殖能力下降(P＜0.01)，黏附能力也明显下降(P＜0.01)。4．BM-EPC和late EPC心肌内移植后都可以整合到血管中，形成新生血管。与对照组比较，BM-EPC移植和late EPC移植都明显增加毛细血管密度(P＜0.01)，BM-EPC组血管密度高于late EPC组(P＜0.01)。与对照组比较，BM-EPC移植减少心肌纤维化面积(P＜0.05)，而late EPC移植则无此作用(P＞0.05)。BM-EPC移植提高射血分数(P＜0.05)，而late EPC移植则无此作用。BM-EPC移植促进VEGF和bFGF的表达(P＜0.05)，late EPC移植组与对照组无差别(P＞0.05)。结论：1．高糖环境对BM-EPC和late EPC功能的影响在体内和体外均存在差异。四氧嘧啶诱导的体内高糖环境对BM-EPC的数量和增殖、黏附无抑制作用，但抑制late EPC的数量、增殖和黏附。体外高糖环境呈浓度依赖性抑制late EPC的增殖，但不抑制BM-EPC的增殖。2．高糖抑制late EPC表达VEGF和bFGF，高糖对BM-EPC表达VEGF无影响，30mmol／l高糖也抑制BM-EPC表达bFGF。3．高胰岛素抑制late EPC表达VEGF以及bFGF，抑制BM-EPC表达bFGF。4．BM-EPC心肌内移植通过促进血管发生和动脉生成、旁分泌VEGF和bFGF的机制改善糖尿病兔急性心肌梗死后的血管再生，提高心功能。Late EPC移植不能改善心功能。