论文部分内容阅读
目的：现有研究表明自由基一氧化氮(NO)对基因表达具有广泛的调节作用,但N0对肿瘤组织特异性溶瘤病毒转染后外源基因表达的调节作用及其机理尚不清楚。本研究旨在以重组溶瘤腺病毒Ad-UPII-E1A转染膀胱肿瘤细胞为观察体系,阐明N0在膀胱癌特异性溶瘤腺病毒基因治疗肿瘤中的作用及可能机理。方法：常规培养膀胱肿瘤BIU87和5637细胞株,以硝普钠作为外源性N0的供体,应用PTIO和L-NMMA分别作为内源性NO的清除剂和诱导性一氧化氮合酶(NOS)的抑制剂,采用Nitrate/Nitrite Assay Kit检测N0和／或病毒作用前后膀胱肿瘤细胞培养液中的N0水平。采用空斑形成实验(PFU)等方法测定重组病毒Ad-UPII-ElA的滴度和纯度。应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测NO对重组病毒抗肿瘤细胞增殖的影响；透射电镜观察腺病毒颗粒进入细胞情况和亚细胞结构变化；实时定量PCR法和蛋白印迹法分别检测E1A、iNOS以及Ras/MAPK通路基因Ras、P38、ERK、JNK在转录和翻译水平的相对表达量；应用流式细胞术检测N0和／或重组病毒作用膀胱肿瘤细胞后细胞周期和凋亡情况。采用SigmaPlot11.0和SPSS13.0软件通过Student t检验和方差分析对数据进行统计处理。结果：膀胱肿瘤细胞BIU87和5637本身培养液中N0水平很低,给予外源性NO供体后N0水平随时间延长而升高。重组病毒Ad-UPII-E1A具有很高的纯度和滴度,并能通过E1A基因发挥溶瘤作用。NO能够促进该病毒转染入BIU87、5637细胞,50uM和100uM NO联合Ad-UPII-E1A 30MOI作用后能够促进肿瘤细胞的增殖,而200uM NO联合重组腺病毒作用后则促进肿瘤细胞的死亡,且NO对Ad-UPII-E1A的作用具有时间依赖性。透射电镜观察发现,重组病毒Ad-UPII-ElA能够进入并在膀胱肿瘤细胞内复制,而N0能够提高病毒的转染效率并引起肿瘤细胞自吞噬和凋亡。N0联合腺病毒作用后能够使肿瘤细胞周期阻滞于G2/M期。50uM和100uM NO能够抑制E1A基因在转录和翻译水平的表达,而200uM NO能够上调E1A的表达；给予外源性NO后能够上调iNOS的表达,而PTIO和L-NMMA能够下调iNOS的表达水平。通过检测Ras/MAPK信号通路基因Ras、JNK、ERK、P38在转录和翻译水平的表达,发现N0与腺病毒联合作用较单独腺病毒作用肿瘤细胞后,Ras、JNK和ERK在转录和翻译水平的表达量均相应增高,而P38的表达量减低。结论：自由基一氧化氮能够促进溶瘤腺病毒Ad-UPII-ElA转染膀胱肿瘤细胞的效率,但N0因其浓度不同对溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有双向凋节作用,低剂量的NO能够下调重组病毒E1A的表达从而促进肿瘤细胞增殖,而高剂量的N0能够上调E1A的表达因而发挥溶瘤效应。外源性NO和通过iNOS产生的内源性NO都能发挥调控病毒基因治疗膀胱肿瘤的作用,其机理可能与细胞周期G2/M期阻滞以及细胞凋亡有关,而Ras/MAPK信号通路参与了NO对溶瘤腺病毒治疗膀胱肿瘤的调控作用。