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背景增生性瘢痕(hypertrophic scars,HS)是在损伤修复过程中形成的异常瘢痕,以细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)过度沉积,以及真皮组织过度增生为特点,是严重烧伤后常见的临床并发症。由于HS组织中成纤维细胞分泌的基质蛋白与正常组织中的基质蛋白有所不同,其弹性和强度都大为降低,使组织产生物理和生理功能的明显缺陷,严重影响创面的修复质量。目前,HS的形成机制仍未完全阐明,但其与机械力作用的密切关系人所共知。临床研究表明,HS常发生在皮肤牵张力较大的部位,伴有极少量的异常细胞;基础研究也表明,HS的发生更多是由于机械张力作用引起的细胞功能改变所致;机械力牵拉使创面修复过程中ECM的成分和结构发生改变,产生了更多的胶原沉积和纤维化;细胞对机械力信号的感知及响应,是机械力介导的纤维化的基础。作为伤口愈合的主要修复细胞之一,真皮成纤维细胞的结构和功能受到机械力负荷的显著影响。机械力负荷增加,使成纤维细胞的胞膜延展,细胞骨架重排,促进真皮成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,表现为α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)表达增加,胶原合成增加,收缩力增强,但具体的调节机制尚未完全阐明。转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)是肌成纤维细胞功能活化的重要分子,能促进创面新生肉芽组织的胶原过度沉积及纤维化,与瘢痕增生的关系最为密切。有研究表明,TGF-β1受到机械力信号的调节:在稳态下,TGF-β与包括非活性相关肽(latency-associated peptides,LAPs)、TGF-β结合蛋白(latent TGF-β-binding proteins,LTBPs)在内的大前体复合物(large latent complex,LLC)一起受限于ECM中。当组织发生损伤后,由于TGF-β可与整合素结合,显著增加的机械力可通过整合素的信号传导,使TGF-β从LLC上释放;后者与TGF-β的I型和II型受体结合,继而活化Smad蛋白,促进增生性瘢痕的生长。体外研究证实,周期性机械力牵拉可使TGF-β1的水平显著增加,提高下游磷酸化Smad2介导的转录。这些研究提示,TGF-β1在机械力引起的增生性瘢痕形成中可能起重要作用,但是其在机械力作用下的具体调节机制尚不明确,寻找机械力作用下TGF-β1的抑制因子,可能有助于控制机械力作用下增生性瘢痕的生长。近年研究发现,真核起始因子6(eukaryotic initiation factor 6,eIF6)1可在转录水平调节TGF-β1的表达;皮肤损伤后,eIF6敲降小鼠的TGF-β1表达较野生型小鼠显著升高,α-SMA阳性的肌成纤维细胞也显著增加,因此eIF6参与调控肌成纤维细胞的分化,影响胶原合成及增生性瘢痕的形成。但在机械力负荷增加、TGF-β1表达上调的情况下,eIF6是否能响应机械力的变化,并在TGF-β1调节中继续发挥重要作用,从而影响成纤维细胞的稳态及修复组织的纤维化程度,尚没有相关的研究报道。研究内容及方法本课题利用体内、体外机械力牵拉模型,观察eIF6及TGFβ/Smad通路在机械力介导的相关变化及在纤维化中可能的调节作用。体内研究部分:利用原创的小鼠部分真皮损伤建模工具,在野生型(WT,eIF6+/+)小鼠及eIF6敲降(eIF6+/-)小鼠背部建立部分真皮损伤创面模型;并利用皮肤缺损张力缝合技术及无张力缝合技术,控制小鼠背部的部分真皮损伤创面模型的牵张力水平,从而将小鼠分为“假手术对照组”和“张力增加组”(根据需要对两组设置“单纯牵拉组”、“LY21097612处理组”及“DMSO3对照组”三个亚组);在制创后3d、5d、7d、14d和21d,观察各组小鼠部分真皮损伤创面的愈合情况;取部分真皮损伤创面及创周1mm范围内的皮肤组织,进行石蜡包埋切片及肉芽组织的总蛋白提取;利用HE染色、Masson染色、免疫组化染色、免疫荧光染色及Western Blotting等技术,观察创面新生肉芽组织的面积、胶原沉积情况,以及eIF6、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)等蛋白表达的变化。体外研究部分:原代培养野生型(WT,eIF6+/+)及eIF6敲降(eIF6+/-)新生小鼠真皮成纤维细胞,将第2~3代细胞转至Bioflex?六孔板上,分别设置“未牵拉对照组”及“机械力牵拉组”(根据需要对两组设置“单纯牵拉组”、“LY2109761处理组”及“DMSO对照组”三个亚组),对细胞进行0.1Hz、10%形变的循环机械力牵拉刺激,牵拉时间设置为4h、8h、16h和24h。利用免疫组化、免疫荧光、Western Blotting等技术,观察小鼠真皮成纤维细胞eIF6、TGF-β1、COL1A1、PCNA、α-SMA、TGF-β/Smad通路相关蛋白的表达变化,利用q RT-PCR技术检测eIF6、TGF-β1、PCNA及COL1A1m RNA的表达变化。结果本实验利用原创的小鼠部分真皮损伤建模工具,结合缺损皮肤张力风和技术,成功建立了小鼠部分真皮损伤机械力牵拉动物模型。体内、体外研究显示,机械力牵拉显著增加COL1A1、TGF-β1及eIF6的表达,促进小鼠创面新生组织中真皮成纤维细胞的增殖。体外研究表明,eIF6敲降使机械力牵拉作用下小鼠真皮成纤维细胞COL1A1的表达较野生型显著增加,并促进TGF-β/Smad信号进一步活化;利用LY2109761抑制TGF-βI/II型受体,能显著降低eIF6+/-小鼠真皮成纤维细胞的COL1A1表达;体内研究也表明,eIF6敲降使机械力牵拉作用下小鼠部分真皮损伤创面新生组织较野生型显著增加。利用LY2109761抑制TGF-βI/II型受体,能显著降低eIF6+/-小鼠部分真皮损伤创面新生组织体积。全文结论机械力牵拉促进小鼠部分真皮损伤创面真皮成纤维细胞的增殖,并显著增加COL1A1和TGF-β1的表达,同时也使eIF6表达水平显著增加;eIF6敲降显著增加机械力牵拉作用下小鼠部分真皮损伤创面肉芽组织的生长,在体外可促进机械力作用下真皮成纤维细胞TGF-β/Smad信号的传导,显著增加COL1A1表达。因此,eIF6可能部分通过TGF-β/Smad通路参与机械力介导的真皮成纤维细胞功能调节。