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产肉量是衡量家畜生产能力的重要性状,而动物肌肉生长发育对产肉量起到至关重要的作用。肌肉干细胞（Muscle stem cell,Mu SC）作为肌源性祖代细胞在肌肉发育与再生过程中发挥关键作用。骨骼肌生长发育是一个复杂的过程,涉及多个转录调控、表观遗传和信号通路因子,其中DNA甲基化作为最普遍且作用明显的表观调控方式占据重要地位。TET2（Tet methylcytosine dioxygenase 2）是DNA去甲基化过程中的关键性酶,主要功能是催化DNA去甲基化过程。目前关于DNA甲基化与肌肉发育相关研究主要集中在DNA甲基化图谱与肌肉发育机制之间关系,但在DNA去甲基化酶TET2对肌肉生长和发育调控方面的研究仍不多,其具体机制仍有待进一步研究探讨。本研究发现肌肉干细胞在分化过程中TET2表达显著提高,且在猪肌肉干细胞中TET2敲低显著抑制细胞的增殖和分化功能,表明该因子对猪肌肉生长发育和产肉性状具有潜在调控作用。随后,通过构建全身性TET2敲除小鼠（TET2-knockout,TET2-KO）模型深入研究TET2在肌肉发育和再生中的功能,并检测了TET2-KO小鼠肌肉发育和再生过程相应表型变化,进一步结合TET2-KO肌肉干细胞的转录组和全基因组甲基化数据,鉴定出多种关键性调控因子,并解析关键调控因子TET2缺失导致的肌肉干细胞发育缺陷的挽救作用的分子机制。具体结果如下:1.TET2抑制影响猪肌肉干细胞增殖分化本研究通过增殖与分化肌肉干细胞的转录组数据分析发现TET2基因在肌细胞分化时期上调表达。基于该基因在肌肉干细胞不同时期的表达变化,本研究通过si RNA干扰猪肌肉干细胞中TET2表达。结果表明TET2敲低显著抑制猪肌肉干细胞增殖分化能力。2.TET2缺失影响小鼠体重及肌肉组织本研究通过构建TET2-KO小鼠模型探究TET2缺失后的小鼠肌肉表型差异。在形态变化上,TET2-KO小鼠形态显著小于WT小鼠。在体重变化方面,2及8周龄两个发育时间点TET2-KO小鼠体重显著低于同周龄的WT小鼠。在肌肉组织变化上,8周龄TET2-KO小鼠的胫骨前肌（Tibialis anterior,TA）组织形态大小显著小于同周龄的WT组,并且这种缺陷具体表现在肌肉组织横截面积以及肌纤维数量上。同时新生以及成年TET2-KO小鼠的肌肉干细胞数量都显著少于相同发育阶段WT小鼠,并且新生TET2-KO小鼠肌肉干细胞增殖能力显著弱于WT小鼠。3.TET2缺失影响肌肉干细胞本研究从TET2-KO及WT小鼠中分离出新鲜肌肉干细胞进行体外分析。在肌肉干细胞增殖方面,TET2-KO肌肉干细胞中增殖细胞比例显著低于WT细胞,并且增殖相关转录因子如MCM2（Minichromosome Maintenance Complex Component 2）和CDKN1B（Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1B）等的表达水平也出现显著变化。在细胞分化能力方面,TET2-KO肌肉干细胞分化成多核肌管能力显著低于WT细胞,肌源分化相关调控因子（MYOG,MYH1）在TET2-KO Mu SC中表达水平出现明显降低。4.TET2缺失影响肌肉再生在肌肉再生方面,TET2-KO小鼠相比于WT小鼠在肌肉再生和修复方面存在缺陷和延迟。此外,本研究对比了不同损伤修复时期体内肌肉干细胞损伤激活情况,发现损伤后3天与20天TET2-KO小鼠肌肉干细胞激活数量都显著低于对应WT小鼠。5.TET2-KO Mu SC转录组分析本研究针对TET2-KO及WT MuSCs进行RNA-seq测序,鉴定出987个差异表达基因（Differentially expressed gene,DEGs）,其中包括431个上调表达的DEGs和556个下调表达DEGs。同时,上调DEGs主要富集在组织形态发生和细胞增殖的负调控等生物学功能,而下调DEGs主要富集在肌肉组织发育和钙离子跨膜运输调控。鉴于钙信号通路相关基因在TET2-KO MuSCs中出现显著下调,本研究通过检测TET2-KO和WT细胞内钙离子水平发现TET2-KO MuSCs中的钙离子水平显著低于WT MuSCs。并且,钙信号通路相关调控因子在TET2-KO MuSCs中表达水平显著降低。在TET2敲低的猪肌肉干细胞中,也发现胞内钙离子浓度显著下降,其相关钙信号通路相关调控因子表达出现显著下调。6.TET2-KO Mu SC甲基化组分析本研究针对TET2-KO及WT MuSCs进行全基因组甲基化测序WGBS（Wholegenome bisulfite sequencing）,鉴定出11,502个差异甲基化区域DMR（Differentially methylated regions）,其中64.4%为超甲基化区域。同时,大部分超甲基化的DMRs位于内含子、远端基因间区域和启动子区域。超甲基化基因的主要富集在离子运输、细胞粘附和骨骼肌组织发育的调控有关生物学功能上。从超甲基化基因和表达下调基因的重叠分析中鉴定175个候选基因,并且这些候选基因相关的信号通路主要富集在钙离子信号通路上。本研究进一步分析钙离子通路基因转录起始位点TSS（Transcription start site）上下2KB区域的甲基化水平,发现TET2-KO组中启动子和基因编码区域的甲基化水平显著高于WT组。随后,钙通路基因的m RNA表达水平和甲基化水平的关联分析显示Prkcb、Slc8a3、Avpr1a和Ednra在高甲基化和下调的基因中表现更为突出。7.外源性Slc8a3恢复TET2-KO MuSCs的功能本研究通过Slc8a3抑制剂（KB-R7943）处理WT MuSCs,发现处理之后细胞其胞内胞内钙离子浓度和细胞的增殖能力都显著降低。随后,通过构建外源性Slc8a3表达载体在TET2-KO MuSCs中过表达Slc8a3,并比较TET2-KO组和Control组和过表达Slc8a3 TET2-KO组中胞内钙离子浓度、细胞增殖能力和分化能力等表型差异。在钙离子调控方面,本研究发现TET2-KO-Slc8a3组的胞内钙离子浓度显著高于TET2-KO组,并且钙信号通路相关基因的表达显著升高。在细胞增殖方面,TET2-KO-Slc8a3组细胞增殖显著高于TET2-KO细胞。同样地,增殖及肌源性相关转录因子表达水平在TET2-KO-Slc8a3组中出现明显变化。分化能力方面,Slc8a3过表达恢复TET2-KO成肌分化能力,肌源性分化相关基因的表达水平也在TET2-KO-Slc8a3组中显著上调。本研究通过TET2基因与肌肉干细胞发育机制研究,揭示了TET2在肌肉发育过程中关键调控机制以及对猪肌肉干细胞关键作用,同时揭示DNA甲基化调控对农业动物产肉性状上的潜在影响,为改良畜禽的产肉性状提供功能基因和候选靶点。