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碳水化合物是人体能量的主要来源,而长期高碳水化合物膳食会导致糖代谢的紊乱甚至会引发糖尿病等重大疾病。预防和改善糖尿病的方法之一是干扰葡萄糖的吸收和降低餐后血糖。α-淀粉酶负责催化淀粉的水解,是主要的消化酶之一。寻找与开发α-淀粉酶抑制剂,是一种预防和治疗糖尿病的有效途径。相关研究表明许多药食同源植物(MFHP)中活性成分具有明显的α-淀粉酶抑制作用,有开发为α-淀粉酶抑制剂、降低餐后血糖的潜能,目前尚未有对MFHP抗α-淀粉酶分子进行系统的筛选及机理研究。为此,本课题以延缓淀粉消化,降低餐后血糖为目的,以α-淀粉酶为靶标,通过分子对接对MFHP化学成分数据库进行α-淀粉酶抑制剂的虚拟筛选,并对其延缓淀粉消化的作用机制进行研究,同时通过酶法修饰进一步获得活性改善的新物质,扩大其作为膳食补充剂和营养补充剂在辅助治疗糖尿病,降低餐后血糖中的应用。主要研究内容和结果如下:采用基于分子对接的虚拟筛选方法结合体外α-淀粉酶抑制活性实验,快速鉴定了MFHP化学成分数据库中的α-淀粉酶抑制剂。首先建立MFHP化学成分数据库,将α-淀粉酶与MFHP化学成分数据库中的小分子化合物应用AutoDockVina进行分子对接,根据结合能排序后,选取前547个潜在活性化合物应用CDOCKER和Surflex-Dock进行二次交叉对接,综合考虑三种打分函数后筛选出24种潜在活性化合物进行验证。这24种化合物根据分子结构可被分为黄酮、黄烷-3-醇和异黄酮等,表明只有某些特定多酚是有效的α-淀粉酶抑制剂。层次聚类相互作用谱图结果显示His305,Asp300,Glu233,Val163,Tyr62,Gln63,Trp59是小分子活性化合物与α-淀粉酶相互作用的关键氨基酸。α-淀粉酶抑制活性实验结果表明在同等浓度下(0.5μmol/L),表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG),表儿茶素没食子酸酯(ECG)和原花青素对α-淀粉酶的抑制率为9.98%,25.82%和21.33%,高于其他测试样品,说明黄烷-3-醇多酚具有良好的抗α-淀粉酶活性。证明虚拟筛选可以应用于α-淀粉酶抑制剂的快速筛选和鉴定中。从抑制α-淀粉酶的活性和与淀粉的相互作用两个角度研究黄烷-3-醇多酚(ECG、EGCG和原花青素)延缓淀粉消化的机理。从酶抑制实验、抑制动力学类型、荧光光谱、和计算机模拟四个方面研究了黄烷-3-醇多酚与α-淀粉酶的相互作用特性。研究结果表明ECG、EGCG和原花青素均为有效的α-淀粉酶抑制剂,其IC50值分别为172.21±0.22μg/mL、732.15±0.13μg/mL和504.45±0.19μg/mL,LineweaverBurk双倒数曲线表明ECG、EGCG和原花青素对α-淀粉酶的抑制作用类型分别是混合型抑制、非竞争型抑制和混合型抑制。荧光光谱显示ECG、EGCG和原花青素均能对α-淀粉酶产生静态猝灭。热力学参数、分子对接和分子动力学模拟证明,氢键和范德华力是ECG和EGCG-α-淀粉酶复合物的主要驱动力,而原花青素-α-淀粉酶复合物是由疏水作用驱动。此外,通过淀粉-碘络合物光谱表明ECG和EGCG与支链淀粉和直链淀粉均存在较强的相互作用,而原花青素与支链淀粉和直链淀粉均存在较弱的相互作用,其中EGCG对淀粉的相互作用强于ECG。Englyst体外模拟消化结果表明,当EGCG,ECG和原花青素添加量为10%时,显著降低快消淀粉(RDS)含量(9.84%,3.64%,29.51%)和显著增加抗性淀粉(RS)含量(11.90%,6.18%,25.92%)。通过酶促合成ECG酰化衍生物并考察其对淀粉消化的影响。通过单因素实验确定ECG衍生物酶促合成的最优条件为脂肪酶TLIM添加量为10%(w/w底物),底物摩尔比为50(乙/丁酸乙烯酯:ECG),50℃反应5天。在该条件下,ECG乙酰化转化率和ECG丁酰化转化率分别达到70.16%和72.73%。采用硅胶柱层析法分离ECG酰化衍生物,V(氯仿):V(甲醇):V(甲酸)=9:1:0.1的流动相进行洗脱。分离产物经核磁共振分别鉴定为5-1-O-乙酰基ECG(1A-ECG),3,5-2-O-乙酰基ECG(2A-ECG),5-1-O-丁酰基ECG(1B-ECG),3,5-2-O-丁酰基ECG(2B-ECG)。1A-ECG,2A-ECG,1BECG,2B-ECG对α-淀粉酶的IC50值分别为144.22±0.11μg/mL,426.96±0.24μg/mL,235.76±0.15μg/mL,545.34±0.27μg/mL。荧光光谱显示1A-ECG,2A-ECG,1B-ECG,2B-ECG均能对α-淀粉酶产生静态猝灭。热力学参数和分子动力学模拟证明,氢键和范德华力是1A-ECG-α-淀粉酶复合物的主要驱动力,而2A-ECG,1B-ECG,2B-ECG与α-淀粉酶复合物是由疏水作用驱动。体外模拟消化结果显示,相比较阴性对照ECG组,当添加量为10%时,酰化产物与玉米淀粉共同糊化能形成更多含量的抗性淀粉。其中ECG乙酰化产物形成的抗消化淀粉含量并不随加入量的增加而显著改变,而ECG丁酰化产物加入量增加会逐步提高抗消化淀粉的含量。这些结果表明酶酰化选择性取代可以提高ECG的抑酶活性,同时形成更多含量的抗性淀粉。