基于Fosmid文库和PCR筛选技术的蜘蛛包卵丝蛋白基因克隆及分析

来源 :东华大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kmweiran
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
蜘蛛丝具有多样的分子结构及生物生态学功能,同时还具有强度高、弹性好、初始模量大、断裂能大、可生物降解、生物相容性好、保湿性好、轻盈等其它合成高性能纤维所无法比拟的优良机械性能及特性,因而,在纺织、航天航空、生物医学以及军事等领域具有广泛的潜在应用前景。   然而,蜘蛛具有种内残食性且蛛丝产量较低,因而,采用大规模饲养蜘蛛以获取蛛丝的方法是不可取的,目前以基因工程的方法获取蛛丝蛋白是首选策略。研究表明包卵丝的韧性极其优越,因此,本实验通过构建大腹园蛛基因组Fosmid文库以钓取包卵丝蛋白全长编码基因,从而为后续仿生蛛丝的研究奠定基础。   包卵丝蛋白主要分为葡萄状丝蛋白和管状腺丝蛋白,本实验主要围绕这两种蛋白开展研究:   1.成功分离葡萄状腺体及管状腺体并获取其高质量总RNA,并通过巢式PCR技术获取悦目金蛛葡萄状腺丝和管状腺丝部分cDNA序列,并对其的分子机制进行了探索与讨论,初步阐释了包卵丝蛋白的结构模式和进化演变,为包卵丝全长基因的克隆及仿生研究提供了前期研究基础:   2.通过3’-RACE的方法成功获取大腹园蛛葡萄状丝CTR序列及两个完整的重复单元,为AcSpl编码基因的结构解析提供了参考,并为进一步研究蛛丝蛋白基因结构特点及人工仿生蜘蛛丝奠定了理论基础:   3.建立了适于提取大腹园蛛HMW-gDNA的方法-改进的CTAB法,并在此基础上,成功构建了无偏向性的A.ventricosus Fosmid基因组文库,对30~40 Kb的外源片段经过补平磷酸化、连入pCC2FOSTM载体、lambda噬菌体包装蛋白进行体外包装、转染EPI300TM-T1R E.coli,成功共构建了A.ventricosus Fosmid基因组文库。5次包装滴定度处于6.0×104~1.1×105之间,共产生约2.99×105个文库克隆,覆盖A.ventricosus全基因组约5倍;   4.建立了基因组文库的PCR逐级筛选系统:该方法基于384-well plate构建Fosmid基因组文库的板混合池、行混合池和列混合池,利用特异性引物对混合池进行筛选以确定阳性克隆的精确位置,该方法既保留了常规PCR文库筛选方法的简捷经济的特点,又弥补了筛选周期长、工作量大等缺点。   通过本实验研究,成功获取了悦目金蛛(Argiope amoena)和大腹园蛛(Araneus ventricosus)包卵丝蛋白编码基因,并成功构建了大腹园蛛基因组Fosmid文库并建立适于基因组文库的PCR逐级筛选系统,为后续的筛选工作奠定了基础。
其他文献
  目的 在农村饮水安全保障中,探索建立水务、卫生、环保、教育和基层政府联动的机制,形成信息交流的互动平台,确保供水安全。方法 采用现场调查及深入访谈的方法,调查农村供水
会议
  研究乙醇和乙酸铅联合染毒对胎鼠脑新皮质神经干细胞凋亡的影响和机制.方法 取Sprague-Dawley胎鼠脑新皮质神经干细胞悬液,分设对照组、乙醇(25、50 mmol/L)单独染毒组、
会议
请下载后查看,本文暂不支持在线获取查看简介。 Please download to view, this article does not support online access to view profile.
期刊
  目的 通过比较、分析不同天然雾霾性空气污染条件下研究对象的主观感受、痰液炎性因子等急性效应指标的差异,为大气污染对呼吸系统急性损伤评价提供科学依据.方法 测量环
会议
森林作为陆地生态系统的主体,在全球生态系统中具有举足轻重的作用,其服务功能价值的评价是一个研究热点。分析与评估某一区域森林生态系统服务功能的经济价值,对区域的经济
  目前,空气细颗粒物PM2.5 暴露对人体健康的危害已有广泛研究,但其确切的分子毒理机制还不清楚.本研究利用二维凝胶电泳和质谱技术研究PM2.5 暴露下人肺上皮细胞A549 的蛋
会议
面对原油的重质化和日益严格的环境要求,加氢工艺的氢气需求量急剧增加。目前,一半以上的炼油厂出现氢气资源短缺的现象。因此,合理利用现有的氢气资源,降低新鲜氢气的消耗量,具有
  目的 探讨饮水氟暴露和卵泡刺激素受体基因(FSHR)rs1394205多态性对女性下丘脑-垂体-卵巢轴激素的影响.方法 依据水氟检测结果,在河南省通许县随机选择7 个村庄作为调查
会议
肝脏是体内功能最多、最复杂的脏器,是一个物质合成、代谢与代谢调节的场所,是生理和病理状态下,能量代谢、毒素的生物转化以及血浆蛋白质合成的中心器官,是机体最重要的器官之一
本试验以结球甘蓝不同熟性的6个品种为材料,对影响其原生质体培养的主要因素进行了探讨;初步建立了适合结球甘蓝原生质体游离、纯化、收集、培养以至再生出完整植株的实用技术