论文部分内容阅读
第一章腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在晶状体上皮细胞中的转染和表达目的：研究2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus type 2，rAAV2）载体介导增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养兔晶状体上皮细胞（N／N1003A）中的表达，以及病毒载体转染对晶状体上皮细胞增殖的影响，为rAAV2携带治疗基因防治后囊膜混浊提供理论依据。方法：rAAV2-EGFP按感染复数（multiplicity of infection，MOI）为104、105、2×105、106转染N／N1003A细胞，相差显微镜观察rAAV-EGFP转染对细胞生长和形态的影响；转染后每天在倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达，于转染后1、3、5、7、9d，记录200个细胞中EGFP阳性表达所占的百分比；当EGFP表达稳定后激光共聚焦显微镜照相。转染后第2、7d流式细胞仪检测rAAV2-EGFP对N／N1003A细胞的转染效率。MTT比色法测定rAAV2-EGFP对N／N1003A细胞增殖的影响。结果：rAAV2-EGFP转染N／N1003A细胞后1d便可见较弱的EGFP阳性表达，EGFP在细胞中的表达呈绿色，弥漫于整个胞浆。rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加，转染后7d达到高峰并维持。当MOI=106时，转染后第7d达到71.52％±0.50％。转染组和对照组细胞的形态特征无明显改变，MTT法显示各转染组OD值与未转染组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论：重组腺相关病毒载体可以介导增强型绿色荧光蛋白基因稳定转染晶状体上皮细胞，并且转染效率高，腺相关病毒是后囊膜混浊基因治疗的良好载体。第二章携带HSV-TK基因的重组AAV载体的构建及表达目的：构建含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK，制备重组腺相关病毒rAAV2／HSV-TK，并检测转染TK基因后晶状体上皮细胞细胞中的整合和表达，为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础。方法：用SalI+EcoRI酶将TK基因从质粒pDC316-TK切出，连接到质粒pSNAV2.0中，构建成重组质粒pSNAV2.0-TK，分别用PCR和上述内切酶鉴定重组质粒；以该质粒转染BHK-21细胞，在G418压力下筛选得到携带载体质粒pSNAV2.0-TK的载体细胞株，并在辅助病毒HSV1-rc／ΔUL2的参与下包装重组病毒rAAV2／HSV-TK；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法和高效液相色谱（HPLC）法检测rAAV2／HSV-TK的纯度；用DNA斑点杂交方法检测纯化的rAAV2／HSV-TK的滴度；重组病毒rAAV2／HSV-TK转染N／N1003A细胞，用PCR和RT-PCR分别检测TK基因的整合和表达。结果：重组质粒pSNAV2.0-TK PCR扩增的片段大小和酶切鉴定所切下的片段与预计结果一致；SDS-PAGE法检测到三条特征性的AAV外壳蛋白条带，HPLC法检测rAAV2／HSV-TK的纯度＞98％；用DNA斑点杂交方法检测rAAV2／HSV-TK的滴度为1×1012v.g.／ml；感染了重组病毒rAAV2／HSV-TK的N／N1003A细胞有TK基因的整合和表达。结论：成功构建了携带TK基因的重组载体质粒pSNAV2.0-TK，制备了高纯度、高滴度的重组腺相关病毒rAAV2／HSV-TK；转导重组病毒rAAV2／HSV-TK的晶状体上皮细胞中有TK基因的整合和有效表达。第三章重组腺相关病毒介导HSV-TK／GCV系统对晶状体上皮细胞的作用目的：观察2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus type 2，rAAV2）载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simpl exvirus thymidine kinase，HSV-TK）基因／丙氧鸟苷（ganciclovir，GCV）系统对体外培养兔晶状体上皮细胞的杀伤效应，并初步探讨晶状体上皮细胞死亡的机制。方法：利用携带HSV-TK基因的2型重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus type 2，rAAV2）载体rAAV2／HSV-TK感染体外培养的兔晶状体上皮细胞N／N1003A，联合使用GCV治疗，以没有转染重组病毒的细胞作为对照，MTT法观察不同浓度GCV和作用时间对细胞存活率的影响；分别将转染了HSV-TK基因的N／N1003A-TK细胞与正常N／N1003A细胞按不同比例混合培养，观察HSV-TK／GCV系统的旁观者效应；以不同感染复数（MOI）的重组病毒rAAV2／HSV-TK转染N／N1003A细胞，观察MOI对HSV-TK／GCV系统杀伤效应的影响。应用透射电镜观察、Hoechst33258染色等方法观察细胞凋亡、坏死改变，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果：实验组各浓度GCV作用下的细胞存活率与对照组比较差异均有显著的统计学意义（P＜0.01），实验组GCV的IC50为2mg／L，对照组IC50为524mg／L，治疗指数为262。N／N1003A-TK细胞的存活率随GCV的作用时间延长而下降；N／N1003A-TK细胞与正常细胞混合培养，N／N1003A-TK细胞占10％时，混合细胞存活率仅51.47％±1.44％；GCV对细胞的杀伤效应随着MOI的升高而增加。N／N1003A-TK细胞在GCV作用下出现明显的细胞凋亡现象，细胞的凋亡率7.18％±2.04％，与对照组（3.50％±0.56％）比较差异有统计学意义（P＜0.01）；S期细胞百分比为11.86％±3.71％，高于对照组5.48％±1.54％，差异有统计学意义（P＜0.01）；G0／G1细胞所占比例为65.94％±4.88％，较对照组（81.1％±6.22）明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：GCV可有效杀伤重组腺相关病毒rAAV2／HSV-TK转染的晶状体上皮细胞，并具有较强的旁观者效应；HSV-TK／GCV系统引发的细胞死亡可能与凋亡及坏死两种机制有关。重组腺相关病毒载体介导的自杀基因疗法有可能成为后囊膜混浊的有效治疗方法。