钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的一种人兽共患病,是我国的法定乙类传染病之一.同时钩端螺旋体病在世界范围内也多次爆发过局部范围的流行,其中包括一些发达国家和地区,钩端螺旋体病依然是一种危害严重、威胁人类健康和畜牧业生产的传染病.安全有效的疫苗是防治钩端螺旋体病的最好方法.钩端螺旋体疫苗先后经历了传统的全菌体疫苗、改良的浓缩疫苗和外膜疫苗时期,对防治钩端螺旋体病作出了贡献.但是它们共同的缺点是免疫力不够持久,需要每年在疫区进行免疫接种,同时都具有一定的副作用,并且对不同血清型的钩端螺旋体不能引起交叉免疫保护,这些缺点限制了钩端螺旋体疫苗的应用.现在钩端螺旋体研究领域的重点之一是新型疫苗的研制,其核心是寻找合适的疫苗候选基因. 钩端螺旋体基因组学和功能基因组学的发展使得以新的理论和方法在钩端螺旋体基因组中筛选疫苗候选基因成为可能.在第一部分,根据逆向疫苗学的理论,通过生物信息学、比较基因组学杂交和转录组学分析等方法筛选钩端螺旋体基因组中的疫苗候选基因.P-CLASSIFIER 程序用来预测问号钩端螺旋体赖型赖株蛋白质的亚细胞定位,SignalP3.0预测钩端螺旋体赖株蛋白质中的信号肽,TMHMM预测钩端螺旋体赖型赖株蛋白质中的α-穿膜螺旋结构,BOMP用来预测钩端螺旋体赖型赖株中的β-桶型外膜蛋白,SpLiP预测钩端螺旋体赖株中的脂蛋白.BLASTP程序用来比对钩端螺旋体赖型赖株和哥本哈根型Fiocruz L1-130株之间以及钩端螺旋体赖型赖株和人之间的同源蛋白质.生物信息学方法初步筛选出616个疫苗候选基因.问号钩端螺旋体赖型赖株基因组芯片用来进行比较基因组学杂交和转录组学分析.在中国流行的10个血清群代表株中,比较基因组学杂交试验鉴定出307个差异基因,转录组学结果显示有1427个基因为高转录基因,它们的信号值分别为Cy3≥342,Cy5≥363.5.在616个疫苗候选基因中去除307个差异基因后的基因数为565个基因.565个基因与1427个高转录基因的交集为226个基因.应用逆向疫苗学的理论,通过生物信息学、比较基因组学杂交以及转录组学等技术方法,最终从钩端螺旋体赖株4727个ORF中筛选出226个钩端螺旋体疫苗候选基因.这226个疫苗候选基因编码的蛋白质不但预测位于钩端螺旋体表面、在两株测序钩端螺旋体中保守,在中国流行的10个血清群代表株中也是保守的,并且在体外具有较高的转录水平. 本课题的第二部分选择了10个预测表达于外膜的疫苗候选基因(LA0272、LA0301、LA0365、LA0957、LA1100、.LA1404、LA1495、LA2395、LA3469和LB061)进行了克隆表达以及鉴定.通过对选择的10个预测表达于外膜的疫苗候选基因进行克隆表达,得到了纯化的重组蛋白质,然后根据逆向疫苗学的理论,ELISA检测重组蛋白质的免疫原性,Western blot检测疫苗候选抗原在钩端螺旋体赖株兔血清中的相应抗体,荧光激活的细胞分选仪(Fluoresence-activated cell sorter,FACS)检测疫苗候选抗原是否为钩端螺旋体的表面暴露蛋白质,Western blot检测它们在15个中国流行的血清群代表株中的保守性.结果显示10个疫苗候选抗原都具有较好的免疫原性.除LA2395外,其余9个疫苗候选抗原都能在钩端螺旋体赖株兔血清中检测出相应的抗体.FACS检测结果显示,除LA0272、LA0365和LA1404外,其余的7个疫苗候选抗原均为表面暴露蛋白质.在7个表面暴露蛋白质中,除LA2395外的其余6个蛋白质在我国流行的15个血清群代表株中均保守.因此在选择的10个疫苗候选抗原中,LA0301、LA0957、LA1100、LA1495、LA3469和LB061等6个疫苗候选抗原不但具有较好的免疫原性,在钩端螺旋体赖株兔血清中存在抗体,FACS检测证实均为钩端螺旋体细胞的表面暴露蛋白质,而且在15个血清群的代表株中高度保守,值得进一步深入研究. 通过对选择的10个疫苗候选基因进行鉴定和进一步的筛选,初步验证了课题第一部分的实验结果,显示了利用逆向疫苗学研究钩端螺旋体疫苗候选基因的优点.同时也为后面大规模疫苗候选基因的进一步筛选和鉴定构建了实验平台,为钩端螺旋体新型疫苗的研发奠定了基础.