目的：　　 全世界范围内,中枢神经系统感染的发病率和死亡率都很高。其中,新生儿细菌性脑膜炎是中枢神经系统最严重的疾病之一,发病率约为1‰。临床上尽管有针对细菌的抗生素和相关的支持疗法,但仍有5％～40％患儿的死亡,存活患儿中30％留有永久性神经系统后遗症,诸如癫痫、智力和运动障碍等。因此探讨有效防治新生儿细菌性脑膜炎具有重要意义。　　 大肠杆菌K1株(Escherichia coli K1,E.coli K1)是引起新生儿细菌性脑膜炎最常见的病原体。E.coli K1是通过血行穿过血脑屏障(BBB)播散入脑致病的。BBB是由脑微血管内皮细胞(BMECs)、星形胶质细胞、周细胞构成的结构和功能性屏障,它能够调节分子进出大脑从而维持神经中枢系统微环境的稳定性[1]。研究表明:体外培养的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的单层细胞和新生鼠血源脑膜炎可以作为研究人BBB体外、体内模型,并且E.coli K1侵袭进入HBMECs是其通过BBB播散入脑的关键步骤。在E.coli Kl侵袭进入HBMECs单层细胞过程中,HBMECs表面能够形成微绒毛状膜(Microvilli-like membrane protrusion)突出,细胞内部细胞骨架肌动蛋白发生重排及引起相应的一些信号分子活化,如FAK,paxilin,PI3K,Rho-GTPases等,这些都有利于E.coli K1通过拉链式机制(Zipper-likemechanism)侵袭进入HBMECs。目前,利用功能基因组学已经鉴定出E.coli K1中与侵袭有关的基因(OmpA、IbeA、IbeB、和CNF1),而且有些与侵袭有关的因子在HBMECs中找到了相应的受体。例如E.coB K1的CNF1可以和HBMECs表面的Laminin受体发生相互作用,并激活小分子GTP酶RhoA,使HBMECs出现绒毛样突起结构,进而促进E.coli K1侵袭进入HBMECs。因此,从大肠杆菌的致病因子出发研究致病菌与宿主细胞的相互作用是探讨细菌穿过血脑屏障机制的有效途径。　　 IbeB基因是我室陈誉华教授在研究.E.coli K1穿过血脑屏障机制的过程中,在E.coli K1中克隆的一个与E.coli K1侵袭HBMECs、穿过血脑屏障相关的基因;通过进一步研究,我室人员采用酵母双杂交技术从HBMECs cDNA文库中筛选出与IbcB蛋白相互作用的P190蛋白。P190蛋白是单次跨膜糖蛋白,属于NCP(NeurexinⅣ-P190-Paranodin)蛋白家族,NCP蛋白家族主要调节神经原-胶质细胞,胶质细胞一胶质细胞的相互作用。研究显示,在有髓神经元形成过程中,P190蛋白与Contactin蛋白形成低聚物,富集在神经元轴突细胞膜上特定区域,与髓鞘形成细胞上的配体相互作用形成结旁区(Paranodes),从而保证神经冲动快速、有效的传递。　　 本实验可望进一步研究P190蛋白在细菌穿越血脑屏障过程中的作用及其引起的HBMECs中信号通路变化,为找到治疗中枢神经系统的炎症性疾病的有效办法提供理论依据,以利于下一步的工作。　　 方法：　　 1、P190蛋白在HBMECs中的表达情况　　 (1)细胞培养　　 HBMECs培养于含10％胎牛血清和10％新生牛血清的RPMI1640培养液。　　 (2)应用RT-PCR方法分析HBMECs中P190是否表达。　　 (3)Western-blot方法分析HBMECs中P190是否表达。　　 (4)糖苷酶处理后,Western Blot检测P190蛋白分子量的变化。　　 (5)ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction kit提取HBMECs不同组分蛋白。　　 Western-blot方法分析HBMECs中P190在细胞中定位。　　 (6)免疫沉淀法　　 检测HBMECs中P190是否在细胞膜上表达。　　 (7)免疫荧光法　　 检测P190在HBMECs中定位情况。　　 (8)P190全长基因编码区的克隆,不同真核表达载体的构建。　　 (9)筛选稳定转染的高表达P190的HBMECs细胞株,免疫荧光法观察P190的定位情况。　　 2、探讨P190蛋白在E.coli K1侵袭HBMECs中的作用　　 (1)应用荧光实时定量PCR法分析在E.coliK1侵袭HBMECs过程中P190mRNA表达的变化。　　 (2)应用Western-blot方法分析E.coli K1侵袭HBMECs过程中P190蛋白表达的变化。　　 (3)免疫沉淀法方法检测E.coli K1侵袭HBMECs过程中细胞膜上P190蛋白的变化。　　 (4)应用siRNA技术,脂质体转染HBMECs,筛选稳定的P190 Knock down的HBMECs细胞株(即HBMECP190-RNAi)。　　 a.重组质粒pRNA-U6.1/neo的构建　　 b.稳定转染HBMECs细胞　　 c.筛选稳定P190 Knockdown的HBMECs细胞株　　 (5)真核表达载体构建,脂质体转染HBMECs,筛选稳定的P190胞内段缺失的HBMECs细胞株(即HBMEC190AC)。　　 a.真核表达载体pcDNA3.1-Myc/his-P190AC的构建　　 b.稳定转染HBMECs细胞株　　 c.筛选稳定P190胞内段缺失的HBMECs细胞株　　 (6)细菌侵袭实验检测E.coli K1对HBMECP190-RNAi、HBMECP190△C细胞株侵袭力的影响。　　 (7)细菌侵袭实验检测E.coli K1对转染P190全长基因的HBMECP190-RNAi细胞侵袭力的影响。　　 (8)GST-P190胞外段(1-355AA)融合蛋白和P190抗体对E.coli K1侵袭进入HBMECs的影响。　　 3、E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P190蛋白引起HBMECs内下游信号通路的变化　　 (1)免疫沉淀法方法检测E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P190和P13K、Src相互作用的变化。　　 (2)GST-pull down方法检测P190胞内段与PI3K亚单位P85的相互作用。　　 (3)Western-blot方法检测E.coli K1侵袭HBMECP190-RNAi、HBMECP190△C过程中pAKT/AKT、p-Src/c-Src信号通路的变化。　　 结果：　　 1、P190蛋白在HBMECs中的表达　　 (1)RT-PCR方法和Western-blot方法检测出P190在HBMECs中表达。　　 (2)P190蛋白为膜蛋白,并且在HBMECs细胞膜上表达。　　 (3)免疫荧光观察到P190在HBMECs细胞核周围表达。　　 (14)获得P190高表达稳定转染的HBMECs,免疫荧光观察到P190在细胞核周围聚集。　　 2、P190蛋白参与E.coli K1侵袭进入HBMECs的过程　　 (1)E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P190 mRNA表达水平逐渐升高,15分钟达到高峰。　　 (2)E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P190蛋白总量升高,细胞膜表面的P190蛋白逐渐升高,5分钟达到高峰。　　 (3)获得P190 knock down稳定转染的HBMECs(即HBMECP190-RNAi),E.coliK1侵袭实验显示进入HBMECP190-RNAi细胞中细菌的数量明显减少。　　 (4)E.coli K1对转染P190全长基因的HBMECP190-RNAi细胞株的侵袭实验显示,进入细胞的细菌数量明显增多。　　 (5)获得P190胞内段缺失的HBMECs细胞株(即HBMECP190△C),E.coli K1侵袭实验显示进入HBMECP190△C细胞中细菌的数量明显减少。　　 (6)GST-P190胞外段(1-355aa)融合蛋白和P190抗体都能减少E.coli K1侵袭进入HBMECs的数量。　　 3、PI3K/AKT参与P190蛋白介导的E.coli K1侵袭HBMECs过程　　 (1)E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P85和P190相互作用增加,5分钟达到高峰。　　 (2)P190胞内段与P85间的相互作用是间接的。　　 (3)E.coli K1侵袭HBMECP190-RNAi、HBMECP190△C过程中,AKT磷酸化水平普遍降低,并且出现延迟活化。　　 结论：　　 E.coli K1侵袭HBMECs过程中,P190蛋白可能作为细菌侵袭因子的受体活化PI3K/AKT信号分子,促进E.coli K1侵袭进入HBMECs。