鉴于黑曲霉(Aspergillus niger)能够产生多种胞外水解酶的能力，本文以黑曲霉FJ—008为出发菌株，研究报道了饲用复合酶高产菌株的选育、发酵工艺的优化、变株SL2—111产酸性蛋白酶的提取、纯化与酶学特性等方面的实验结果。 一、饲用复合酶高产菌株选育的研究 对出发菌株黑曲霉GJ—008进行紫外线、紫外线和亚硝基胍复合诱变后，获得1260个单菌落，从琼脂块鉴定板上挑选到139株变异辐度较大的菌株。将上述139株变异株，按鉴定板上单菌落透明圈的直径大小排列，把变异株透明圈直径大于对照株透明圈直径20％的取值为1，小于20％的取值为-1，其余取为0。从这三个区域中随机取样，共挑取16株变株。把这16株变株和对照株进行三角瓶固体发酵，测定酸性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶三种酶的发酵酶活，重复试验三次，结果取平均值。获得一株复合酶高产菌株SL2—111。 变株SL2—111形态与出发株FJ—008有所区别：SL2—111在查氏培养基平板上生长较缓慢，30h才出现针尖大的菌落，而原始菌株FJ—008在20h就出现了针尖大的菌落，但变株SL2—111形成孢子的时间较早，菌落周围放射状钩纹较少，菌落背面色素较浅，皱褶较少。 变株SL2—111在基础发酵培养基上，变温培养72h，每克鲜曲酸性蛋白酶发酵酶活可达4525U／g、果胶酶7015U／g、纤维素酶4497U／g，分别比出发菌株FJ—008提高了97.9％、70.1％和13.4％。突变株SL2—111经斜面传代培养5代，产酶特性稳定。 对16株经紫外线和亚硝基胍复合诱变后突变株三角瓶固体发酵培养后，用SPSS10.0对这些菌株所产的酸性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶发酵酶活力进行相关分析，结果表明：酸性蛋白酶发酵酶活力与纤维素酶、果胶酶发酵酶活力的变化呈正相关，因此可以初步选择酸性蛋白酶发酵酶活力的高低作为复合酶菌种筛选及其培养特性研究的依据。 二、变株SL2—111固体发酵工艺 以酸性蛋白酶发酵酶活为响应值，采用单因素搜索和正交试验对变株 SLZ一门 1固 体发酵工艺进行忧化，结果显示：SLZ—111适宜在高碳低氮的培养基中生长，添加无 机氮源对菌株产酶影响不大。最适培养基的组成为：新鲜鼓皮吕．259、米糠4．5 g、豆饼 粉 1．5 p、mohSO’0．3 p、K。HPO。0刀6 g、CaCI。0．075 g、H。O 8石 ml，pH 5．5；变温 培养，前 30 h 28℃，后 30 h为 23℃，培养时间为 60 h。巴 变株叽2一111的发酵培养可分为两个阶段。第一个阶段为生长培养期N毛4N，这 个阶段菌丝大量形成，基本上不产酶；第二阶段为产抱期（2460 h）。根据这两个阶段不＠同的特征，采用变温培养，可以明显提高产酶量。变株 SLZ一门1采用最适培养基和优 化工艺，在 250 ml三角瓶中进行固体培养验证，酸性蛋白酶发酵酶活可达6428 U／g、 果胶酶酶活 8245 U／g、纤维素酶酶话为 49liU／g，比采用基础培养基和原始工艺分别提 高了 42％、17％和 10％。 三、变株乱八 酸性蛋白酶的分离纯化 1、黑曲霉酸性蛋白酶的提取 比较 0．IM pH 3．5乳酸缓冲液、蒸馏水、0．IM HCI、 2％NaCI等不同溶剂从发酵后的固体基质中提取酸性蛋白酶，结果表明：用 0．IM pH 3．5 乳酸缓冲液浸提，酶粉中酸性蛋白酶提取最完全。与 2 ％ NaCI对比，回收率提高约 50％。 在此基础上，对影响酶提取的主要因素，如提取溶剂pp、提取时间、浸提液和固体培 养基的比率进行了研究，确立了最适的酶提取工艺。认为用酶曲重量 10倍的 0．IM PHS刀 的磷酸氢二钠－柠梭酸缓冲液于40’C浸泡60min，酸性蛋白酶提取最完全。 2、黑曲霉酸性蛋白酶的纯化 变株肛一门 1发酵后的粗酶液经硫酸按 40％一80 ％分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和 Sephadex G－75凝胶柱层析， o分离得到组分S—l，酶的回收率为50．56o，提纯倍数为38．l。SDS一PAGE电泳检测， 结果呈现一条清晰蛋白带，表明经纯化的酸性蛋白酶已达到电泳纯。 必 四、变株 SLZ—111酸性蛋白酶的酶学性质 对提纯后的变株 SLZ——111酸性蛋白酶进行酶学性质分析，表明 SLZ—111酸性蛋 白酶的最适作用 pH为 3刀，在 pH 4．0－5．5范围内酶活基本稳定，室温下放置 24小时可 保存活力在85％以上；酶反应的适宜作用温度范围为50．65’C，最适反应温度为60C。 2 该酸性蛋白酶有较好的热稳定性，在 40C或 50t下处理 60 min，仍保持 85％以上的活 力。在室