论文部分内容阅读
植物雄性不育(male sterility,MS)是指在植物的生长过程中,其雄性器官发育异常,但雌性器官均正常发育的现象,是作物生殖生物学研究中的一个重要性状,与作物杂种优势的利用息息相关,在作物育种工作以及分子生物学研究中起着重要的作用。烟叶生产上直接应用烟草雄性不育系时,更容易做到品种产区定位生产。但目前生产上能够利用的不育系来源单一,仅有来源于N.suaveolens的细胞质不育基因成功利用,导致烟草杂交种的推广应用存在极大的风险。为了拓宽烟草不育基因的来源,本研究选用在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和辣椒(Capsicum annuum L.)等植物上报道有控制育性功能的ms1基因和作为启动子控制烟草育性的TA29基因进行研究,对Ntms1基因进行生物信息学分析、预测其是否控制烟草育性,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Ntms1、TA29两个基因的CRISPR/Cas9载体,以烟草品种K326、TN90进行遗传转化,鉴定筛选转化突变体,分析了突变体的突变效应,明确了Ntms1、TA29两个基因具有控制烟草育性的功能,获得了烟草雄性不育系新材料,得到如下结果:1.ms1基因生物信息学分析用生物信息学预测方法分析两个目的基因编码的蛋白质的理化性质、二级结构、亲疏水性及磷酸化位点等,分析结果表明,三个蛋白质的序列相似度为94.43%,其基因编码产物的功能结构域都为PHD功能结构域,蛋白质的二级、三级结构都极为相似,均含有磷酸化识别位点,且都不具有跨膜区和信号肽,进化树分析结果显示,两个基因具有一定的亲缘关系,因此,推测Ntms1基因与Cams1基因可能具有相同的功能。2.Ntms1、TA29基因克隆及载体构建用在NCBI上下载的Ntms1序列在Primer6.0软件中设计特异性引物,以烟草品种K326及TN90的cDNA为模板序列,对目的基因CDS进行PCR扩增,产物进行电泳后割胶回收并与T载体进行连接,测序工作陕西博瑞德生物科技有限公司,得到序列结果后分别将其命名为Ntms1-1、Ntms1-2;TA29基因(Gen Bank登录号LOC107824681)直接在NCBI网站上下载,克隆同ms1。通过对三个基因序列分析,用靶点设计网站选择位于外显子区域且评分较高的靶点序列,重组载体采用的是能够高效的用于双子叶植物的拟南芥U6启动子,采用能高效表达Cas9蛋白和潮霉素抗性基因的加强型Ca MV 35启动子,将两靶点序列与CRISPR/Cas9载体系统连接,最后构建了4个目的基因敲除载体(MSG1(单敲Ntms1-2基因)、MSG2(单敲Ntms1-1基因)、MSG3(双敲Ntms1-1、Ntms1-2基因)、MSG4(单敲TA29基因))。3.重组载体遗传转化实验采用农杆菌介导的烟草叶片遗传转化法,遗传转化K326、TN90两种实验材料,将幼嫩叶片经消毒、侵染及培养,直至长出抗性苗,最终共获得转化植株440株,其中,MSG1载体104株(突变株采用字母A开始编号),MSG2载体41株(突变株采用字母B开始编号),MSG3载体176株(突变株采用字母C开始编号),MSG4载体119株(突变株采用字母D开始编号)。4.转化株筛选鉴定采用PCR的方法用Cas9基因和潮霉素分别设计引物,进行转化植株阳性检测,转化植株阳性率达到80%以上(同时具有Cas9基因和潮霉素)。在靶位点两侧分别设计引物,以从转化单株中提取的DNA序列为模板,进行靶位点序列扩增,将PCR产物送往公司测序,测序结果与野生型序列比对分析,碱基发生变化的植株确定为突变株,结果显示靶点产生突变的植株分别有:MSG1载体95株(其中1株为TN90),MSG2载体37株,MSG3载体166株,MSG4载体109株。5.突变效应分析对突变植株目的基因表达量、花器官表现型、花粉活力、叶片MDA含量进行检测,分析结果显示:18株突变植株目的基因表达量显著降低,平均是野生型的0.6倍;2株突变株出现雄蕊低于雌蕊,结实率约为野生型的50%且种子小而轻;11株突变植株有活力花粉比例显著降低,平均是野生型的0.15倍;9株植株叶片MDA含量显著增加,是野生型的1.42倍;通过遗传转化与突变效应分析,分别获得了Ntms1、TA29转化突变株16株、2株。结果表明Ntms1、TA29具有控制烟草育性的功能。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,明确了Ntms1、TA29具有控制烟草育性的功能,且获得了育性较低的突变体。后续通过自交的方法筛选本研究中获得的部分不育植株,今后有望育成烟草新不育系,对于促进烟草不育性的研究及其在烟叶生产上的利用有极为重要的科学价值和实践意义。