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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的革拉斯氏病的病原体,可引起以猪多发性浆膜炎和关节炎等症状。近年来,随着我国规模化养猪场的发展,该病已经成为猪发病率和死亡率增加的重要原因之一。本研究对2012年-2014年期间江西地区HPS临床分离株在已进行琼脂扩散试验方法血清型分型基础上进行ERIC-PCR基因型分析。通过对副猪嗜血杆菌hhd A基因克隆,并在进行HPS hhd A蛋白生物学信息预测的基础上,将HPS hhd A蛋白进行原核表达与鉴定,以及进一步研究其免疫原性,具体如下:1、2012年-2014年江西地区HPS分离株ERIC-PCR基因分型研究以15株副猪嗜血杆菌不同血清型的标准菌株为参照,对2012~2014年江西地区的41株HPS分离株进行基因分型,总共56株菌(41株HPS江西分离株和15株参考菌株)被分为44个基因型,之前无法通过血清分型的8株菌株均得到ERIC-PCR基因分型充分分型,从而弥补了传统血清分型方法不能完全分型的缺陷。2、副猪嗜血杆菌hhd A基因的克隆与生物信息学分析本研究应用PCR技术成功的扩增了副猪嗜血杆菌的hhd A基因序列,获得了长1797bp的hhd A基因,编码599个氨基酸,推导出蛋白质的分子量大小为61.1k Da的亲水性蛋白;该蛋白由内向外和由外向内各有可能一个跨膜区域;通过蛋白质的信号肽预测hhd A蛋白无信号肽,为细胞内蛋白;对hhd A蛋白的二级结构进行了预测和分析,结果显示hhd A含有较多α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲等二级结构,而且有较多柔性区域,呈散在分布。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384)中对应的核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸同源性99.8%,测定表明HPS的hhd A基因十分保守。3、HPS hhd A基因的原核表达及其免疫保护作用的研究将扩增的hhd A基因克隆于原核表达载体p ET-32a(+)中构建重组表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,后转化至受体菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析重组hhd A蛋白的表达情况和反应原性。重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,检测其特异性血清Ig G抗体水平及攻毒保护率。结果表明,SDS-PAGE得到约82 KDa与预期分子质量大小一致蛋白;Western blot分析显示,该重组蛋白具有良好反应原性。动物免疫保护试验结果表明,重组hhd A蛋白免疫后能诱导产生高水平的hhd A特异性抗体,并对副猪嗜血杆菌强毒菌株的攻击的提供50%保护率,说明hhd A是副猪嗜血杆菌的一种保护性抗原。