论文部分内容阅读
犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染引起的一种急性传染病,以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征,并可引起犬急性心肌炎。鹅细小病毒感染又称为小鹅瘟(Gosling Plague),是由鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)引起的一种发病急、死亡率高的高度接触性传染病,主要侵害30日龄以内雏鹅及雏番鸭,以肠道栓塞为特征性病变。由于预防上述两种细小病毒感染的弱毒疫苗自身存在不足,不能达到理想的保护效果,人们期待研制开发更安全有效的新型疫苗。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向,通常是将编码靶抗原或病原体特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌并在其中有效表达和向体内免疫系统提呈表达的抗原,有效激发机体的免疫应答,以期达到预防一种或多种疾病的作用。由于作为载体菌的减毒病原菌存在一定的毒力回复风险,被公认为食品安全级(Generally Recognized As Safe,GRAS)微生物作为载体菌成为研究和开发的靶向,其中以非致病性革兰氏阳性乳酸菌为典型代表。乳酸菌是人和动物肠道内的益生菌,具有免疫修饰、佐剂活性和许多特定生物学特性使其作为口服疫苗并能有效激发黏膜免疫的安全活菌载体具有广阔前景。本研究以诱导机体产生中和抗体并起主要免疫保护作用的GPV VP3蛋白和CPV VP2蛋白为靶抗原,选择乳酸乳球菌作为疫苗载体,旨在分别构建表达诱导机体产生中和抗体并起主要免疫保护作用的GPV VP3蛋白和CPV VP2蛋白的重组乳酸乳球菌,以期获得能安全有效预防GPV和CPV感染的口服活菌疫苗。其主要步骤为:用PCR方法分别从GPV核酸和质粒pGEX-6P-1-VP2中扩增出GPV VP3基因和CPV VP2基因,将它们克隆入T载体,进行酶切分析和测序鉴定后,分别克隆入诱导型分泌表达载体pNZ3004和pXYSEC:Nuc,采用PCR、酶切分析鉴定为阳性重组克隆后,进一步通过电转化将上述含GPV VP3基因和CPV VP2基因的诱导型分泌表达载体重组质粒DNA分别导入乳酸乳球菌NCDO2118宿主菌,获得重组乳酸乳酸球菌pNZ3004-GVP3/NCDO2118菌株和pXYSEC:CVP2/NCDO2118菌株。SDS-PAGE结合Western blot检测分析表明,重组乳酸乳球菌最佳诱导条件为:30℃厌氧培养至适宜OD600 (0.4～0.6),分别加入终浓度为1%乳糖和0.5%木糖诱导表达10小时(OD600 1.5左右)。细胞裂解液中诱导表达的GPV VP3蛋白和CPV VP2蛋白能与鹅抗GPV高免血清或鼠抗CPV高免血清发生特异性免疫学反应。上述研究结果表明,分别成功构建了表达GPV VP3蛋白和CPV VP2蛋白的乳酸乳球菌pNZ3004-GVP3/NCDO2118菌株和pXYSEC:CVP2/NCDO2118菌株,有待于作进一步深入研究并为研制开发用于预防GPV和CPV感染的新型细菌载体疫苗提供技术基础。