论文部分内容阅读
山羊的繁殖性能影响山羊产业发展,大足黑山羊具有性成熟早、繁殖力高的特性,是提升养羊经济效益的优良种质资源,但其高繁殖调控机理尚不明确。卵巢颗粒细胞对卵泡发育和类固醇激素合成起着非常重要的调节作用,进而影响山羊的繁殖性能。miRNAs具有非常广泛的基因调节功能,它们在卵泡生长发育、卵母细胞成熟、排卵和黄体形成等生理过程中都发挥着重要的作用。尽管有研究表明miR-495-3p通过靶向调节基因表达决定细胞命运,但其在山羊卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。因此,揭示miR-495-3p调节山羊卵巢颗粒细胞功能的作用机制,将为提高山羊繁殖性能提供理论基础。本研究以大足黑山羊卵巢颗粒细胞为研究对象,通过免疫组化、miRNA过表达或干扰、q RT-PCR、Western Blot、流式细胞术、转录组测序和双荧光素酶报告等技术,探究miR-495-3p对山羊卵巢颗粒细胞凋亡、增殖及类固醇激素分泌的影响机制,得到了如下结果:1.miR-495-3p促进卵巢颗粒细胞凋亡,抑制其增殖本研究通过将mimics和inhibitor转染到卵巢颗粒细胞中,构建miR-495-3p的过表达和抑制模型。结果发现,过表达miR-495-3p显著促进颗粒细胞凋亡,抑制miR-495-3p阻碍其凋亡（p<0.05）。进一步检测发现,过表达miR-495-3p显著提高了促凋亡基因BAX的mRNA和蛋白表达（p<0.01）,抑制了抗凋亡基因BCL2的mRNA和蛋白表达（p<0.01）。抑制miR-495-3p降低了BAX的mRNA和蛋白表达（p<0.01）,而对BCL2的表达无显著影响。结果表明miR-495-3p促进卵巢颗粒细胞凋亡。利用CCK-8分别检测24 h、36 h和48 h细胞增殖活力发现,miR-495-3p呈现时间依赖性的抑制细胞增殖活力。运用流式细胞术发现,过表达miR-495-3p将细胞周期阻滞在G2/M期（p<0.05）。过表达或抑制,miR-495-3p均对PCNA的mRNA水平无显著影响,但过表达miR-495-3p显著抑制了PCNA的蛋白水平（p<0.05）。进一步对细胞周期相关基因检测发现,过表达miR-495-3p显著抑制了CDK4和CCND1的mRNA水平（p<0.05）,对CCNE1无显著影响。抑制miR-495-3p显著降低了CCNE1的mRNA水平（p<0.01）,对CDK4和CCND1无显著影响。结果表明,miR-495-3p抑制颗粒细胞的增殖。2.miR-495-3p调节卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌过表达或抑制miR-495-3p均促进雌二醇（E2）和孕酮（P4）的分泌。进一步分析发现,过表达miR-495-3p尽管对St AR表达无显著影响,但显著促进了3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1的mRNA和蛋白表达（p<0.05）。干扰miR-495-3p抑制了3β-HSD的表达（p<0.01）,促进了CYP11A1的表达（p<0.001）。结果表明,miR-495-3p可能通过调节类固醇激素合成途径关键基因的表达来促进E2和P4的分泌。3.miR-495-3p的靶向关系验证在颗粒细胞中过表达miR-495-3p,运用转录组测序技术筛选miR-495-3p候选靶基因。GO和KEGG富集分析发现,差异表达的mRNA主要富集在与细胞增殖、分化、凋亡和炎症相关的通路。通过对mimics组和mimics NC组的差异表达分析,筛选得到12个差异表达的基因,其中8个下调,4个上调。对8个下调基因进行q RT-PCR验证,发现除HBEGF没有显著差异外,其余7个基因均显著下调（p<0.05）。GO和KEGG富集分析获得对细胞增殖、凋亡相关的信号通路,如生物过程调节（regulation of biological process）、细胞过程（cellular process）、催化（catalytic activity）、运输（transporter activity）、分子转化（molecular transducer activity）、细胞组成（cell part）、细胞（cell）等。对上述7个差异表达的基因（HMOX1、STC1、PLAU、STRA6、F2RL1、GDPD5、C4BPA）3’UTR区与miR-495-3p结合位点分析,发现F2RL1、HOMX1、STC1与miR-495-3p有结合位点。进一步通过双荧光素酶报告验证可知,miR-495-3p与STC1存在靶向关系。综上,本研究证明了:（1）miR-495-3p促进山羊卵巢颗粒细胞凋亡,并抑制其增殖;（2）miR-495-3p可能通过调节类固醇激素合成相关基因的表达,促进E2和P4的分泌;（3）miR-495-3p靶向抑制STC1的表达。研究结果为进一步揭示miR-495-3p靶向调控山羊卵泡发育与闭锁的机制提供理论支撑。