研究背景 颅内动脉瘤(intracranial aneurysm，IA)是脑动脉系统有破裂倾向的局限性病理扩张，动脉瘤破裂引起的蛛网膜下腔出血占全部自发性蛛网膜下腔出血的70％-80％，是神经外科的危重急症之一，患者死亡率、致残率极高，严重威胁着患者的生命健康，同时给家庭和社会也带来了沉重负担。如果在IA破裂前，能及时明确诊断并给予神经介入栓塞或显微外科手术等恰当的治疗，患者预后可以大大改善。但是由于IA的具体病因、发病机制不清，尚未有有效的生化指标可以预测IA的存在，因此目前IA的诊断和筛选主要依靠脑血管造影(DSA)、磁共振血管造影(MRA)和CT血管造影(CTA)。三种诊断方法均费用高昂，难以进行大规模筛查，同时，作为金标准的DSA是有创检查，更难于被检查对象所接受。对IA患者血清进行蛋白组学研究，寻找患者血清中差异表达的蛋白质，并与以往对IA的基因研究资料相结合，不仅有助于从分子水平认识IA的发生发展机制，也可以为IA的筛选和诊断提供有效的分子标记物，并有望为IA的防治提供新的分子靶点。 应用蛋白组学方法，已经发现了许多蛋白的表达差异与特定中枢神经系统疾病相关，例如克一雅氏病可能与载脂蛋白E的表达差异有关，β-2微球蛋白、视黄醇结合蛋白、甲状腺素转运蛋白可能与老年痴呆有关。但是，传统的双向电泳技术灵敏度较低，难以检测低丰度蛋白质，同时由于每块胶只能分离一个样本，因而受人为操作的影响，胶间的差异较大，实验室间可重复性也较差。 双向胶内差异凝胶电泳(Two-dimentional difference in-gel electrophoresis，Z-DDIGE)是近年来发展起来了一项新型电泳技术，该技术使用了一组特殊的CyDyeDIGE荧光染料(Cy2、Cy3、Cy5)，对低丰度蛋白的探测灵敏度大幅度提高，同时由于内标的建立，大大减少了人为因素影响，可信度大幅提高。因而，该技术正受到越来越多蛋白组学研究者的欢迎。颅内动脉瘤患者血清2-D DIGE技术尚未建立，应用该技术寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异蛋白质的研究，目前国内外均未见报道。 研究目的 1．建立颅内动脉瘤患者血清双向胶内差异凝胶电泳技术体系，为下一步利用该技术研究颅内动脉瘤患者血清蛋白组变化奠定基础。 2．寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异的蛋白质，探讨这些蛋白在颅内动脉瘤 发生发展中的作用，为颅内动脉瘤的早期诊断和筛选提供潜在的分子标记物。 3．应用Western blot技术验证质谱鉴定结果的真实性、可靠性。 研究方法 1．收集颅内动脉瘤、脑挫裂伤患者和正常成人血清样本各4例，血清经PROT-BA Kit试剂盒处理后，分别进行不同的CyDye染料交叉标记，然后依次进行双 向胶内差异凝胶电泳、图像扫描并用专用分析软件DeCyder v6.0比较各组样本间蛋白点图像差异，并评估该技术体系。 2．提取颅内动脉瘤患者、脑挫裂伤患者及正常成人血清蛋白，用不同的CyDye 染料交叉标记后依次进行双向胶内差异凝胶电泳以分离蛋白质、图像分析以 寻找表达差异的蛋白点，对表达差异的蛋白点进行基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱分析，获得肽指纹图谱，检索MASCOT数据库鉴定蛋白。 3．收集颅内动脉瘤20例、脑挫裂伤伴蛛网膜下腔出血患者22例和正常成人血清样本21例，提取血清总蛋白，行SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印至醋酸 纤维素膜，与小鼠抗人结合珠蛋白多克隆抗体、山羊抗人间-α-胰蛋白酶抑制 因子重链相关蛋白多克隆抗体、兔抗人α1-抗糜蛋白酶单克隆抗体以及兔抗 人载脂蛋白J多克隆抗体一抗、相应二抗共孵，放入超敏发光液充分浸泡后,置入凝胶成像系统曝光、图像扫描，GnenTool软件测得蛋白条带吸光度值,行各组间匕述蛋白表达量的比较。 研究结果 1．经过双向差异电泳，在所有pH3-10的梯度胶条上均得到了蛋白质表达谱，经软件处理，不同染料标记的样本呈现不同颜色的图谱，在每块胶上均可发现 数以千计的蛋白质点。使用：DeCyder软件分析发现，脑动脉瘤患者与正常成人血清中差异点21个，脑挫裂伤患者与正常成人血清中差异点19个，脑动 脉瘤患者与脑挫裂伤患者差异点10个，各组间差异点有部分交叉，共有38 个点差异表达1.5倍以上。 2．经图像分析发现，有11个蛋白点仅在颅内动脉瘤患者与正常成人间存在有统 计学意义的表达差异，经质谱鉴定，其中的7个蛋白点得以确认为5种已知 蛋白质，分别为：结合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2糖蛋白、载脂蛋白J(凝聚素)及间-α-胰蛋白酶抑制因子重链相关蛋白。这些蛋白在颅 内动脉瘤患者血清中均表达升高1.5倍以上。 3．经凝胶分析仪处理，各实验组均可观察到相应特异性蛋白条带。证明质谱鉴定结果无误。图像及吸光度统计分析均显示，上述蛋白在颅内动脉瘤患者血 清中表达量升高，在脑挫裂伤患者血清中没有表达差异。 结论 1．成功建立了颅内动脉瘤患者血清双向胶内差异电泳技术体系，为研究颅内动脉瘤发生发展分子机制提供了一种有效手段。 2．结合珠蛋白、α1-抗糜蛋白酶、富含亮氨酸α2 糖蛋白、载脂蛋白J(凝聚素) 及间-α-胰蛋白酶抑制因子重链相关蛋白可能通过不同机制参与了颅内动脉瘤的发生发展。 3.通过Westomblot对结合珠蛋白、a1-抗糜蛋白酶、载脂蛋白J(凝聚素)及间-a-胰蛋白酶抑制因子重链相关蛋白的验证证明，双向差异凝胶电泳结合质谱分析所找到并鉴定的颅内动脉瘤患者血清中差异表达的蛋白结果真实可信。