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低聚半乳糖(GOS),是一种天然的功能性低聚糖,其分子结构一般是在乳糖分子的一侧以β(1→3)、β(1→4)、β(1→6)糖苷键连接1-7个半乳糖糖基。因其具有优越的生理功能和理化性质而在近年来获得广泛关注。本研究利用乳酸克鲁维酵母来源的β-半乳糖苷酶水解乳糖进行酶法合成低聚半乳糖的研究,首先对检测方法进行优化研究,应用薄层层析定性、HPLC-ELSD定量技术对低聚半乳糖进行分析;在确定了检测方法后对低聚半乳糖合成条件进行优化;并尝试利用LC-MS技术分析其分子量,从而确定生成的低聚半乳糖的聚合度并分析其结构。最后利用硅胶柱分离方法对反应所得的混合物进行分离,得到的主要结论如下:(1)定性检测利用薄层法,展开剂为正丁醇:乙醇:水=5:3:2;显色剂:1g二苯胺、1ml苯胺、5ml磷酸共溶于50ml的丙酮,可以很好的对低聚半乳糖进行定性。定量检测利用HPLC-ELSD检测技术,采用氨基柱,色谱条件为流动相为乙腈:水=80:20;柱温35℃;流速1.0 m L/min;进样量20μL。检测器条件为:检测器温度80℃,气体流速2.0 m L/min,增益为1。在以上条件下样品中物质峰型良好,利于定量,且峰面积与浓度成线性关系,可以根据样品中各峰面积利用归一化法定量计算。(2)以乳糖为底物,采用商业乳酸克鲁维酵所产β-半乳糖苷酶进行催化作用,生成低聚半乳糖。试验结果表明,反应时间、p H、温度、底物浓度、加酶量对GOS合成均产生不同程度影响,其中最佳反应条件为底物(乳糖)浓度50%,加酶量40 U/g,p H7.5,50℃反应2h,最大产率为23.4%。(3)利用ESI-MS对分离组分进行检测,两组分分子量分别为527和689,经判断其聚合度为3和4,即两组分分别为低聚半乳三糖和低聚半乳四糖。其中低聚半乳三糖通过β(1→4)糖苷键连接β(1→6)糖苷键组成,低聚半乳四糖在还原端存在一个β(1→4)糖苷键和两个由β(1→6)键连接的半乳糖基。(4)硅胶柱分离条件为柱高300 mm,柱体积300 m L,常压自然流速洗脱,上样量2 g,样品胶:样品=2:1,干法上样,洗脱剂为正丁醇:乙醇:水=5:3:2(V:V:V)。