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头孢菌素C酰化酶是能将头孢菌素C分子酰基侧链水解形成7-氨基头孢烷酸的酶。本研究将该酶基因转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在优化发酵培养基后,发酵酶活得到提高。在研究过程中,我们尝试通过以下两个途径提高头孢菌素C酰化酶的酶活。途径一,利用透明颤菌血红蛋白(VHb)能增强菌体对氧的摄取和利用能力,在微氧条件下促进细胞生长和代谢产物的合成,提高头孢菌素C酰化酶的酶活。本文将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)和头孢菌素C酰化酶基因(CPCacy)组合在一起,转化到大肠杆菌细胞中,探究VHb对CPCacy活性的影响。获得转化子pACYCDuet-1-vgb-CPCacy,其酶活比对照转化子pACYCDuet-1-CPCacy高,但是依然比出发菌株pET-28a-CPCacy低。在对出发菌株产酶培养基优化过程中,发现碳源成份甘油对酶活影响明显,随着甘油浓度增加,菌液OD600值出现类似二次生长的变化趋势。在培养基成份中含有葡萄糖的情况下,菌体会优先利用葡萄糖,此时其他碳源的利用会受到限制,若限制菌体对葡萄糖的摄取,可以促进其对其他碳源成份的有效利用。途径二,通过P1噬菌体转导的方法,置换大肠杆菌BL21(DE3)磷酸转移酶系统中的葡萄糖特异性转运蛋白ⅡCBGlc的编码基因ptsG,减少菌体对葡萄糖的转运利用,从而调动菌体其他代谢通路相关酶等蛋白的合成,提高菌体对培养基其他各种碳源成份的利用,增加发酵液的菌密度,提升外源蛋白的合成量,最终获得更高的头孢菌素C酰化酶合成量,提高发酵诱导后的酶活。获得ptsG缺陷型菌株后,将四种表达载体pET-28a-CPCacy、pACYCDuet-1-CPCacy、pETDuet-1-CPCacy和pRSFDuet-1-CPCacy通过化学转化法,转入到无抗性、无ptsG基因的缺陷型BL21(DE3)菌株中,获得四种工程菌。对比研究菌株ptsG基因缺陷对头孢菌素C酰化酶活性的影响,发现四种工程菌的ptsG-型菌株的酶活均高于ptsG+型菌株的酶活,提升最为明显的菌株为pRSFDuet-1-CPCacy(ptsG-),是其ptsG+型菌株的2.86倍。进一步的碳源成份优化研究发现,在LB培养基成份中,添加0.3%甘油或0.3%葡萄糖,均对四种工程菌的酶活有明显的提升。在ptsG+型菌株中,添加葡萄糖成份对酶活的提升效果好于添加甘油的效果;而在ptsG-型菌株中,添加甘油成份对酶活的提升效果更加明显。在菌株pACYCDuet-1-CPCacy(ptsG-)中,添加甘油成份后摇瓶发酵培养测得的酶活平均为4.197U/mL,是其ptsG+型菌株在未添加额外碳源的LB培养基中发酵测得酶活的6.59倍。本研究成功将ptsG-型菌株型BL21(DE3)用于表达头孢菌素C酰化酶蛋白,并且通过优化碳源成份获得明显的效果,为研究提高大肠杆菌头孢菌素C酰化酶的酶活开启了一个新的途径,同时,进一步优化培养基的其他成份及培养条件等因素,有望更进一步提升CPCacy酶活,提高工业化发酵生产头孢菌素C酰化酶的可行性。