马铃薯StCDPK22基因克隆及其功能鉴定

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ZHANGXIANYU0000
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植物和一些原生生物中含有一种特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶——钙依赖性蛋白激酶(CDPKs)。研究发现CDPKs基因参与植物碳/氮代谢循环、气孔运动、生长发育调节、离子和水分跨膜运输、细胞骨架动态变化、非生物胁迫和生物胁迫应答等,并且受赤霉素、生长素、干旱、高盐、低温、病原菌入侵和机械损伤等外界刺激诱导而表达。本研究通过隐马尔科夫模型鉴定了马铃薯StCDPKs基因家族的成员,分析了StCDPKs的基因结构、保守结构域、系统进化关系以及转录和表达模式等,并从RNA转录数据中筛选出StCDPK22作为目的基因,进一步通过生物信息学、亚细胞定位、过表达和抑制表达等技术,对马铃薯StCDPK22基因的生物学功能进行了研究。取得的主要结果如下:1.通过隐马尔科夫模型共筛选出25个马铃薯StCDPKs基因,结合NCBI收录的2个基因,共获得27个马铃薯StCDPKs基因。保守结构域分析发现这27个StCDPK基因在基因外显子-内含子个数和保守结构域上没有太大的差异。27个基因在进化上分为四个亚族。筛选的25个StCDPKs基因在马铃薯不同组织和器官中的转录和表达具有差异性,15个StCDPKs基因在不同处理下也具有明显的差异性表达。2.生物信息学分析表明马铃薯StCDPK22基因总长2488 bp,分布于10号染色体,具有8个外显子。StCDPK22蛋白质含有4个EF-hand,编码524个氨基酸,属于稳定性的中性蛋白。另外,二级结构α螺旋多位于蛋白两端,平均亲水系数为-0.527,亚细胞定位显示该蛋白在细胞质膜和细胞核表达,蛋白互作分析发现StCDPK22能够与多种蛋白相互作用。3.构建了马铃薯StCDPK22基因的过表达载体pBI121-StCDPK22和抑制表达载体pBI121-amiR,通过遗传转化马铃薯微型薯得到两组转基因(OE和RNAi)株系。qRT-PCR检测表明,OE-2中StCDPK22基因表达量相比NT上升38.6%,而RNAi-2中StCDPK22基因表达量相比NT下降7.7%。4.PEG模拟干旱处理下,随着PEG浓度的增加,非转基因(NT)和转基因(OE、RNAi)植株中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性都不同程度增强。不同PEG浓度下,OE-2中SOD和CAT的活性增强较NT多11%和15%左右,而RNAi-2中SOD和CAT的活性增强较NT少9%和6%左右,说明马铃薯处于干旱逆境时,StCDPK22对于增强马铃薯在抗氧化物酶活性方面有重要作用,由此推测StCDPK22基因在马铃薯抵御干旱或者渗透胁迫过程中具有一定的作用。
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