论文部分内容阅读
目的:利用原核表达载体 pGEX-6p-1-PTD4-apoptin表达 PTD4-apoptin,分离纯化后验证PTD4-apoptin诱导Hela细胞凋亡的作用;探讨PTD4-apoptin对促凋亡基因bak/b ax、细胞色素c和Caspase-3及细胞凋亡诱导因子(AIF)的影响,研究apoptin诱导肿瘤细胞凋亡的部分机制。 方法:将原核表达载体 pGEX-6p-1-PTD4-apoptin转化至 Ecoli.BL21(DE3)菌株中,通过 IPTG诱导表达,提取纯化得到目的蛋白。将 PTD4-apoptin,加入 Hela细胞的培养基中作用后,观察 Hela细胞凋亡现象,验证 PTD4-apoptin的凋亡作用,并使用 CCK8试剂盒检测其对 Hela细胞的抑制效果。然后,采用RT-PCR、western-blot检测 PTD4-apoptin作用后,Hela细胞中 bak/bax表达量、细胞色素c和Caspase-3在细胞质中的含量,及 AIF在线粒体和细胞质中的含量变化。利用环孢霉素 A,抑制 AIF从线粒体中释放,检测 PTD4-apoptin对 Hela细胞抑制作用,验证 AIF对 P TD4-apoptin诱导 Hela细胞凋亡作用的影响。 结果:成功获得可溶性的 PTD4-apoptin,能诱导 Hela细胞产生凋亡作用,显著抑制 Hela细胞的生长;PTD4-apoptin作用 Hela细胞后, bak/bax的 mRNA水平和蛋白水平的表达量均显著增高,细胞色素c和 Caspase-3在细胞质中的含量均显著上升, AIF在细胞质中的含量也显著高于线粒体中的含量;当抑制 AIF从线粒体向细胞质中释放时,PTD4-apoptin对 Hela细胞生长的抑制作用下降。 结论:PTD4-apoptin具有诱导 Hela细胞凋亡的活性;PTD4-apoptin可能通过上调bak/bax基因的表达,促使线粒体膜通透性改变,细胞质中细胞色素c和 Caspase-3含量增高,AIF从线粒体中释放到细胞质中,引起 Hela细胞发生凋亡作用。