目的荚膜组织胞浆菌病(HP)是一种烈性真菌传染病,与肺结核等疾病难以鉴别,其严重者可导致死亡,我国过去少见报道,现有增多趋势,在国内该病尚无系统的实验室诊断方法和标准。本研究拟研制荚膜组织胞浆菌病体内诊断试剂荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物(P-HTPM),并建立一套完整的包括荚膜组织胞浆菌病免疫学和分子生物学的实验室诊断方法,为今后的临床研究提供检验技术与实验依据。方法第一部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物的制备首先进行荚膜组织胞浆菌(HC)菌种的生物学特性研究,研究包括该菌的形态特征、培养特性、生化特性及抗原性等方面。采用自制液体培养基表面培养法培养HC,用弱酸和盐析法从HC的培养液中提取和纯化荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物(P-HTPM),制备成实验所用P-HTPM原液,初步检测P-HTPM对免疫豚鼠的皮肤效力试验。第二部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物豚鼠皮肤试验P-HTPM作为迟发型超敏反应(DTH)的变态反应原,以国外参考品HIMN(1:100荚膜组织胞浆菌素滤液制剂稀释液)为对照,研究此蛋白制剂对荚膜组织胞浆菌致敏的豚鼠皮肤试验的效力和敏感性;分别以结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)和卡介菌素纯蛋白衍生物(PPD-B)为对照,探讨P-HTPM与TB-PPD、PPD-B对荚膜组织胞浆菌致敏的豚鼠有无皮肤交叉反应,以及用P-HTPM对皮炎芽生菌、副球孢子菌和马尔尼菲青霉菌致敏的豚鼠进行皮肤试验,确定P-HTPM作为体内诊断制品的特异性。第三部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物为抗原的血清学诊断试验以P-HTPM为包被抗原,通过不同免疫次数获得高效价和低效价免疫血清为抗体,探索各种最适血清学免疫试验方法的检测条件,分别建立酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫胶体金层析试验(GICA),检测荚膜组织胞浆菌免疫血清,评估两种方法的敏感性;分别以P-HTPM、TB-PPD、各种真菌及各种分枝杆菌的菌体上清液为包被抗原,ELISA检测荚膜组织胞浆菌免疫血清,以及其它双相型真菌、念珠菌、曲霉菌免疫血清和多种分枝杆菌免疫血清,了解P-HTPM与这些真菌和分枝杆菌有无血清学交叉反应,评估ELISA方法的特异性。以P-HTPM为包被抗原的GICA试纸条检测HC、其它双相型真菌、念珠菌、曲霉菌免疫血清和MTB免疫血清,评估GICA方法的特异性。第四部分荚膜组织胞浆菌PCR测定针对荚膜组织胞浆菌的特异性抗原M蛋白的编码基因设计引物,以荚膜组织胞浆菌培养物制备的cDNA为模板,检定引物扩增的特异性,分别以8×106CFU/ml和8×100CFU/ml菌悬液的HC膜板为高浓度和低浓度膜板进行扩增,探索并优化PCR体系中影响扩增效果的缓冲液添加剂的有无、镁离子浓度、引物浓度、退火温度等重要因素。将梯度稀释的菌悬液制备的模板进行PCR扩增确定其检测敏感度;扩增其他双相型真菌进行特异性检测,建立实时荧光定量PCR法检测和鉴定荚膜组织胞浆菌的方法。同时与常规PCR法进行比较,扩增HC、其他双相型真菌、常见深部感染之真菌,以及结核分枝杆菌和其他分枝杆菌的模板,采用电泳分析其检测的敏感性和特异性。结果第一部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物的制备成功提取P-HTPM,该提取方法的蛋白产率为18.30±3.27mg/L;蛋白纯度达85%,多糖含量13.16%,核酸含量0.88%;并能诱导致敏豚鼠的特异性皮肤反应。第二部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物豚鼠皮肤试验1.1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的P-HTPM与国外参考品引起皮肤反应的比值为0.9、1.0、1.1和1.2,其2μg /ml的P-HTPM与国外参考品等效。2.P-HTPM对HC致敏豚鼠皮肤反应均为阳性,平均硬结直径(11.2±1.0)mm;但对卡介苗、结核、牛、鸟、蟾蜍、土地、胃、不产色、施氏、次要、产鼻疽、堪萨斯、海、亚洲、瘰疬、戈登、苏加、龟、偶发、耻垢、楚布、猪、母牛等分枝杆菌致敏的豚鼠均呈阴性反应,硬结直径均为0.0mm。3.TB-PPD对结核分枝杆菌(MTB)致敏豚鼠皮肤反应均为阳性,硬结直径(12.9±1.9)mm;但对HC致敏豚鼠皮肤反应为阴性,硬结直径均为0.0mm。PPD-B对牛、鸟、蟾蜍、土地、胃、不产色、施氏、次要、产鼻疽、堪萨斯、海、亚洲、瘰疬、戈登、苏加、龟、偶发、耻垢、楚布、猪、母牛等分枝杆菌致敏的豚鼠皮试均为阳性;但对HC免疫豚鼠皮试为阴性。第三部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物为抗原的血清学诊断试验1.酶联免疫吸附试验试验(ELISA)(1)确定P-HTPM最适工作浓度为1μg/孔,小鼠HC免疫血清最适工作浓为为1:1000。(2)P-HTPM为包被抗原的ELISA,检测20份HC免疫血清,结果均为阳性,A值1.036±0.24;检测MTB免疫血清、其他分枝杆菌免疫血清、念珠菌属、曲菌属和隐球菌属免疫血清结果均为阴性,P<0.01;检测副球孢子菌免疫血清和马尔尼菲青霉菌免疫血清,10份血清中分别出现8份阳性结果;检测10份皮炎芽生菌免疫血清结果均为阳性,A值1.103±0.478,与HC免疫血清相比,差异无显著性意义(P>0.05)。(3)TB-PPD为包被抗原的ELISA检测MTB免疫血清均为阳性,A值1.614±0.272;检测HC免疫血清均为阴性,A值0.052±0.004,P<0.01。PPD-B为包被抗原的ELISA检测其他分枝杆菌免疫血清结果均为阳性,检测HC免疫血清均为阴性。(4)副球孢子菌和皮炎芽生菌为抗原的ELISA检测HC免疫血清,出现阳性率分别为40%(4/10)、70%(7/10),A值分别为0.135±0.053、0.229±0.035;检测两种菌相应的免疫血清结果均为阳性。而马尔尼菲青霉菌为抗原的ELISA检测HC免疫血清,结果却全为阴性。2.免疫胶体金层析试验(GICA)(1)P-HTPM最适喷膜浓度为2mg/ml,检测HC免疫血清结果均为阳性,显色好,能肉眼迅速区分出强阳性和弱阳性结果。(2)终浓度为5mg/ml的BSA封闭抗原效果最好,10份阴性标本检测结果全为阴性,9份阳性标本检测结果未受到影响。而在0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml时阴性血清中2号标本检测结果均为阳性。(3)加入处理液稀释待检血清可提高检出效果,以4:5稀释血清效果最佳,待测液流动快,C线和T线显色均明显,边缘清晰,膜的背景干净,更易于结果的准确判断。(4)GICA检测9份兔HC免疫血清和14份小鼠HC免疫血清均为阳性,阳性检出率100%,与ELISA检测结果相符合,符合率100%。强阳性标本在1:4096稀释时仍能被检出(+),弱阳性标本在1:512稀释时仍能被检出(±～+),表明该GICA方法检测灵敏度高。(5)检测16份小鼠结核分枝杆菌免疫血清,出现1份阳性;检测常见念珠菌和曲霉菌免疫血清全为阴性结果;检测皮炎芽生菌和副球孢子菌血清出现较高的阳性率,分别为86%(6/7)、40%(4/10),与ELISA结果相符合;7份马尔尼菲青霉菌血清检测结果全为阴性,与ELISA结果不相符合。第四部分荚膜组织胞浆菌PCR测定1.用真菌和分枝杆菌的通用引物常规PCR法分别扩增各种膜板,均有阳性产物,表明试验所用各种膜板制备成功;引物D1D2能特异性地扩增荚膜组织胞浆菌,扩增产物的分子量大小为289bp,其序列在GenBank中比对,符合有性期的荚膜组织胞浆菌;扩增其他双相型真菌、念珠菌、曲霉菌、新生隐球菌和结核等分枝杆菌模板时,均无目的条带出现,表明引物D1D2的特异性高。2.实时荧光PCR检测荚膜组织胞浆菌的最低量为8个真菌。3.实时荧光定量PCR反应体系中优化条件如下:检测低浓度模板时,加入适量甲酰胺的反应液可明显改善检测结果。Mg2+>5mmol/L时检测效果较好,扩增高浓度模板时Ct值为21.72±0.33,扩增低浓度模板时Ct值为29.96±2.4。增加Taq酶的用量有利于PCR扩增检测;Cytech公司生产的Taq酶检测效果比其它两个公司的好。引物浓度低时扩增效果稍差,荧光响应强度也较低;退火温度为68℃、70℃、72℃时,对结果无太大影响。结论第一部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物的制备采用盐析和弱酸相结合的方法从荚膜组织胞浆菌中提取荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物的工艺有效可行,蛋白纯度高。第二部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物豚鼠皮肤试验1.2μg /ml的P-HTPM与国外参考品等效。2.P-HTPM能引起HC致敏豚鼠的特异性皮肤反应,与TB-PPD和PPD-B变态反应原无交叉反应,有较高的灵敏性和特异性。P-HTPM皮肤试验可用于荚膜组织胞浆菌感染的流行病学调查和荚膜组织胞浆菌病的辅助诊断。结合TB-PPD皮试,对荚膜组织胞浆菌病和结核病有鉴别诊断价值。第三部分荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物为抗原的血清学诊断试验1.酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA检测荚膜组织胞浆菌抗体敏感性高(100%),P-HTPM与分枝杆菌、念珠菌属、曲菌属和隐球菌属无血清学交叉反应,与副球孢子菌、皮炎芽生菌、马尔尼菲青霉菌有交叉反应。P-HTPM为抗原的ELISA可作为荚膜组织胞浆菌病快速的辅助诊断方法,并能对结核病和常见深部感染真菌病进行鉴别诊断。2.免疫胶体金层析试验(GICA)能高敏感性地检测荚膜组织胞浆菌抗体,与ELISA结果一致。与念珠菌属、曲霉菌属无交叉反应,与皮炎芽生菌和副球孢子菌有交叉反应。P-HTPM为抗原的ELISA可作为荚膜组织胞浆菌病快速的辅助诊断方法。第四部分荚膜组织胞浆菌PCR测定引物D1D2的PCR法检测和鉴定荚膜组织胞浆菌的敏感性和特异性均高,能作为荚膜组织胞浆菌病快速、准确的诊断方法。