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膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈增高趋势，且易复发和进展，预后差。抑癌基因在控制膀胱癌细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负调节作用，并能潜在的抑制肿瘤生长，其功能失活可导致细胞恶性转化，肿瘤发生。它是通过特定的信号转导通路实现其调控作用的。抑癌基因RUNX3表达产物RUNX3作为TGF—β信号转导通路下游的一个非常重要的转录调节因子，其表达下调或缺失将影响TGF—β信号通路的生物活性，进而抑制TGF—β介导的细胞凋亡，引起细胞的异常增殖，最终导致肿瘤的发生。在导师周祥福主任医师的前期研究中发现，80％的膀胱癌组织中RUNX3基因启动子区域CpG岛出现甲基化现象，且浸润性膀胱癌RUNX3发生甲基化的比率明显高于浅表性膀胱癌，而在正常膀胱组织未发现RUNX3基因甲基化而呈高水平表达，但在膀胱癌T24细胞株却未见RUNX3基因表达。
5-氮—2’—脱氧胞苷(5-Aza—2’—deoxycytidine，5-Aza—CdR)是一种特异性DNA甲基转移酶抑制剂，通过去甲基化作用可使多种CpG岛高甲基化的抑癌基因重新表达恢复抑癌功能。本课题拟应用0.5、5和50μ mol/L三种浓度的去甲基化药物5-Aza—CdR作用于膀胱癌T24细胞，甲基化特异性PCR(Methylation—specific PCR，MSP)和非甲基化PCR(un—methylation specific polymerase chain reaction，UMP)检测经5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞RUNX3基因的甲基化状态，半定量RT—PCR检测药物处理前后细胞RUNX3基因mRNA的表达。利用倒置显微镜观察5-Aza—CdR处理前后细胞形态变化，四唑盐(MTT)比色法观察药物处理前后细胞的增殖活性，流式细胞仪分析药物处理前后细胞的凋亡状况。
目的：明确经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞RUNX3基因的甲基化状态；明确经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞RUNX3基因mRNA的表达水平；观察经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞的增殖活性及凋亡状况。
方法：
1.细胞培养及药物处理。人膀胱癌T24细胞株以含10％胎牛血清的RPMI1640培养基于37℃、5％CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞以每板3×105个接种于100mm培养板，24h后加入5-Aza—CdR使其终浓度分别为0.5、5和50μ mol/L，每24 h换液，保持药物终浓度，连续作用3d后弃去药液，以不含药物的培养基继续培养5d。以未经药物干预的细胞作为对照组。
2.MSP检测，经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞RUNX3基因的甲基化状态。应用试剂盒E．Z．N．A．TM SQ Tissue DNA Kit提取经三种浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞的基因组DNA。对基因组进行亚硫酸氢钠修饰，玻璃奶法回收DNA，按照参考文献[8]合成DNA甲基化和未甲基化的特异引物，PCR仪进行甲基化特异性PCR，非甲基化PCR则不进行修饰，直接在PCR仪进行非甲基化PCR检测。反应产物进行电泳及分析。
3.半定量RT—PCR检测经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞RUNX3基因mRNA的表达。应用细胞总RNA提取试剂盒分别提取经三种不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞的总RNA，将总RNA逆转录为cDNA，然后将cDNA产物进行PCR扩增RUNX3基因，进行琼脂糖凝胶电泳。RUNX3的相对表达水平=RUNX3基因的RT—PCR产物电泳条带的密度/GAPDH基因的RT—PCR产物电泳条带的密度。
4.MTT比色法观察经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞的增殖活性。将MTT加入经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞，DMSO充分溶解后，置全自动酶标仪于490nm波长处读取吸光度(A)值，细胞增殖能力以平均吸光度(A)值分析，以A值为纵坐标，时间(d)为横坐标，绘制生长曲线。
5.流式细胞仪检测经不同浓度5-Aza—CdR处理前后的膀胱癌T24细胞的凋亡状况Annexin V—FITC细胞凋亡检测试剂盒处理细胞，进行流式细胞仪检测。
结果：1.药物处理组细胞RUNX3基因MS—PCR检测均呈阴性，UM—PCR均阳性；未经药物处理组细胞RUNX3基因MS—PCR检测阳性，UM—PCR阴性。2.对照组细胞未见RUNX3 mRNA的表达产物条带，而经浓度分别为0.5、5、50μ mol/L的5-Aza—CdR处理后，出现RUNX3 mRNA产物条带的表达，其相对表达量分别为0.51±0.06、0.60±0.04、0.69±0.08，具有剂量依赖关系(P=0.000)。3.T24细胞经3种不同浓度的药物处理后，细胞生长速度受到不同程度的抑制，随着药物浓度的增加抑制作用增强。4.5-Aza—CdR浓度为0.5、5、50μ mol/L时的细胞凋亡率分别为25.82％±1.81％、41.77％±3.25％、66.59％±3.16％，显著高于对照组的4.16％±1.56％(P=0.000)；各不同药物浓度组之间的两两比较具有显著差异(P=0.000)，且凋亡率与5-Aza—CdR浓度具有剂量依赖关系(P=0.000)。
结论：1.膀胱癌T24细胞RUNX3基因启动子区域CpG岛存在甲基化现象，5-Aza—CdR能够逆转T24细胞RUNX3基因这种异常甲基化。2.经5-Aza—CdR处理后的T24细胞RUNX3 mRNA重新表达，且其表达量与药物剂量呈正相关。3.与对照组相比，经5-Aza—CdR处理后的T24细胞增殖明显受到抑制，凋亡增加，与药物存在剂量依赖关系。