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过氧化物酶在植物体内主要有两方面的作用,一方面与植物正常的形态发生和建成有关,在植物的生长、发育过程中起作用;另一方面与植物的抗逆性有关,包括抗旱、抗寒、抗盐和抗病等,是植物保护酶系中重要的保护酶之一。本研究从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总RNA,采用RT-PCR方法得到RsPrx1的cDNA片段,将其克隆到pGEM-T载体中,经测序鉴定为全长编码基因。生物信息学研究表明RsPrx1的转录后加工符合典型的植物基因加工方式。之后构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9KH-RsPrx1,测序表明RsPrx1正确插入α分泌信号开放读码框的下游。将其转化毕赤酵母GS115。转化后的酵母菌株经MD平板筛选后得到阳性重组子,将这些阳性克隆分别用诱导表达培养基BMMY诱导表达,成功分泌表达出具有生物活性的外源过氧化物酶。
外源基因在毕赤酵母中的表达受不同的培养条件影响,因此本研究对表达条件进行优化,得到重组毕赤酵母表达RsPrx1的最佳发酵条件是:以BMMY和BMGY为发酵培养基,培养基起始pH值为7.4,甲醇浓度0.5%,温度26℃,通气面积1.5cm2:为快速且高效地获得分泌表达的RsPrx1蛋白,采取更换培养基的方法,其间只须在达到最大酶活时更换新鲜的诱导表达培养基,经过氧化物酶活性测定发现这种诱导培养方法获得的总酶活是一般的连续培养(只添加YP)的2.59倍;SDS-PAGE分析表明诱导重组质粒表达了融合蛋白,分子量为37KD,与氨基酸序列计算结果一致;活性电泳检测表明重组毕赤酵母表达出来的是具有生物活性的RsPrx1;分别用不同浓度的NaCl和H2O2处理重组毕赤酵母转化子,发现转化子具有一定的抗盐和抗氧化胁迫能力。本研究建立了RsPrx1的重组毕赤酵母表达体系,建立了真核表达具有生物活性的外源过氧化物酶的有效方法,为进一步研究外源POD的性质和功能奠定了基础。