Latexin是一个由222个氨基酸组成的分子量约为29kD的蛋白质。它是哺乳动物中唯一已知的羧肽酶抑制剂。目前,国内外对于Latexin的功能大部分集中在神经与发育以及肿瘤相关研究中,而对于炎症方面的研究非常缺乏且机制相当不明确,因此我们以Latexin在肿瘤细胞炎症反应中的作用为切入点进行研究。本论文主要包括以下内容:第一章,前言。第二章,通过Western Blot、免疫组织化学和细胞免疫荧光技术,分析了Latexin在体外培养细胞系和体内不同组织的分布与表达规律。第三章,通过蛋白质组学策略,进行Latexin蛋白质复合物的鉴定,并运用免疫沉淀及细胞免疫荧光技术,验证相互作用蛋白。第四章,Latexin抗炎机制研究。通过双萤光素酶报告基因系统和qRT-PCR,我们发现Latexin过表达抑制NF-?B-Luc活性以及抑制TNF-α诱导的炎症因子表达(如ICAM1、VCAM1、IL-6等),表明Latexin可以抑制炎症反应;通过细胞免疫荧光和EMSA实验,发现Latexin抑制TNF-α诱导的p65核转移及DNA binding活性;由于p65核转移受I?Bα调控,通过在细胞中转染Latexin过表达质粒或si RNA,发现过表达Latexin延长I?Bα的半衰期,并抑制基础水平及TNF-α诱导的I?Bα降解;在NF-?B信号通路中I?Bα的降解主要由泛素化途径完成,通过免疫共沉淀实验,发现过表达Latexin抑制I?Bα泛素化,敲低Latexin促进I?Bα泛素化。有意思的是,我们发现TNF-α诱导I?Bα泛素化的同时,I?Bα和RPS3的相互作用增强;而过表达Latexin后,I?Bα的泛素化被部分抑制,并伴随I?Bα和RPS3的相互作用减弱,提示RPS3可能介导I?Bα的泛素化。为了进一步探究Latexin影响I?Bα泛素化的具体机制,我们利用免疫共沉淀并结合质谱技术筛选到了与Latexin相互作用的蛋白HECTD1,HECTD1是一个E3泛素连接酶。进一步通过免疫共沉淀和Western Blot技术,我们验证了HECTD1和Latexin以及RPS3相互作用,组成复合物。通过在细胞中敲低HECTD1和RPS3,发现I?Bα的泛素化受到抑制;敲低RPS3后,HECTD1与I?Bα的相互作用减弱,进一步明确了HECTD1和RPS3共同参与I?Bα的泛素化。文献报道Latexin的基因表达调控区域具有数个维甲酸反应元件,我们的实验也证明维甲酸诱导Latexin表达升高,同时HECTD1表达受到抑制。通过在细胞中敲低Latexin,并用维甲酸处理,发现I?Bα泛素化的抑制作用被减弱,并逆转维甲酸对TNF-α诱导炎症因子表达的抑制作用,表明Latexin介导了维甲酸的抗炎症过程。因此,在本研究中我们发现并证明了Latexin抑制TNF-α诱导的炎症反应的新机制:1)Latexin抑制I?Bα的泛素化;2)Latexin、HECTD1及RPS3形成蛋白质复合物,并且Latexin下调HECTD1的表达;3)HECTD1及RPS3参与I?Bα的泛素化;4)Latexin介导了维甲酸的抗炎作用。总之,本研究主要集中探讨了Latexin和HECTD1相互作用来调控炎症反应,阐明了Latexin参与炎症反应的新机制,为明确Latexin蛋白在炎症反应中的作用提供理论依据。