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苏云金芽孢杆菌（Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点,因此必须通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,杀虫晶体蛋白结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点;在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上,可以通过分子设计来改变杀虫晶体蛋白的毒力和杀虫谱,为转基因植物或微生物提供新的基因来源。 本论文围绕苏云金芽孢杆菌工程菌的构建、杀虫晶体蛋白的分子设计、杀虫晶体蛋白的体外结晶等方面进行了一系列的研究,主要内容包括: 将对鞘翅目害虫高毒力的cry3Aα7基因分别通过电击转化到对鳞翅目害虫高毒力的野生菌株G03和UV17中,得到工程菌G033A和UV173A。室内生测结果表明两株工程菌对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫都表现出很高的毒力,其中G033A对鞘翅目害虫榆蓝叶甲和马铃薯甲虫的LC50分别为3.10 mg/ml、0.40 mg/ml,对鳞翅目害虫甜菜夜蛾和小菜蛾的LC50分别为40.30 μg/ml、8.13μg/ml;UV173A对榆蓝叶甲和马铃薯甲虫的LC50分别为1.47 mg/ml、0.31 mg/ml,对小菜蛾的LC50为18.03 μg/ml。工程菌在田间对鞘翅目害虫和鳞翅目害虫也表现出了很好的防效。在用量为40 g/亩时,G033A对甜菜夜蛾的防效达67.9%;在使用浓度为1g/L时,G033A对马铃薯甲虫的防治效果为89.2%,UV173A为94.6%;接近化学农药的防治水平,具有良好的开发和应用前景。 通过监测工程菌在田间的残留、扩散以及对非靶标昆虫的影响,完成了工程菌中间试验和环境释放阶段的安全性评价。评价结果表明工程菌G033A和UV173A在田间存活时间较短,扩散范围较小,对草蛉、瓢虫等非靶标昆虫种群无不良影响。因此认为这两种工程菌使用安全,对于生态环境不会造成有害影响。 为了确定Cry1Ba3的最小活性区,通过PCR扩增获得9种不同长度的cry1Ba3基因片段,分别在大肠杆菌BL21中表达。采用浸叶法测定了相应蛋白片段对小菜蛾的杀虫活性,最终将Cry1Ba3蛋白对小菜蛾的最小活性区确定在第22-655位氨基酸之间。 通过重叠引物PCR得到由Cry1Ca蛋白Domain Ⅰ分别与Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac Domain Ⅲ组合的嵌合基因cry1C1C1Aa、cry1C1C1Ab、cry1C1C1Ac,在大肠杆菌BL21中进行表达;提取三种蛋白,对棉铃虫和甜菜夜蛾进行了杀虫毒力测定。结果表明,与Cry1Ca蛋白相比,三种嵌合蛋白对对棉铃虫的毒力力有不同程度的提高,但对甜菜夜蛾的毒力都有所降低。 通过高效液相色谱纯化了对小菜蛾高毒力的Cry1Ba3-3H蛋白以及对甜菜夜蛾高毒力的营养期杀虫蛋白Vip3A。采用气相扩散法,探索了两种蛋白体外结晶的条件,最终分别得到了方形的Cry1Ba3-3H蛋白晶体和正八面体形的Vip3A蛋白晶体。这些结果将为这两种蛋白的结构与功能解析奠定了基础。